氨茶碱对哮喘呼吸道重塑大鼠支气管组织中Bcl?2及Bax蛋白含量的影响

【摘要】  　　　目的 观察氨茶碱对支气管哮喘呼吸道重塑大鼠呼吸道形态学及气管周围组织中凋亡相关蛋白Bcl?2及Bax含量的影响。方法 SD大鼠随机分为正常组、模型组、治疗组，每组8只，除正常组外以卵蛋白致敏并吸入激发法制备大鼠哮喘模型，治疗组、模型组从第1次哮喘激发开始（造模第15天）分别给予氨茶碱0.035 g·kg-1·d-1、生理盐水2 ml/d灌胃给药，用药4 w后处死大鼠，取肺组织HE染色，病理图像分析仪测量支气管壁面积、支气管平滑肌面积，采用免疫组化法测定支气管上皮及支气管壁周围组织中凋亡相关蛋白Bcl?2及Bax含量。结果 与正常组比较，模型组大鼠支气管壁面积、平滑肌面积明显增加（t=5.13，P=0.00,t=2.85，P=0.00),支气管上皮中凋亡相关蛋白Bcl?2及支气管壁周围组织中Bax含量均明显增加（t=52.4，P=0.00,t=61.0，P=0.00)，治疗组大鼠支气管壁面积、平滑肌面积较模型组显著降低（t=2.77，P=0.00,t=1.26，P=0.01)，支气管上皮中Bcl?2含量及支气管周围组织中Bax含量均显著增加（t=28，P=0.009,t=36.5，P=0.01)。结论 氨茶碱可通过提高支气管上皮中Bcl?2及支气管周围组织中Bax含量抑制哮喘大鼠气管壁、平滑肌增厚，从而抑制支气管哮喘大鼠气管重塑。

【关键词】  氨茶碱；支气管哮喘；气道重塑；Bcl?2；Bax

　　支气管哮喘气管重塑是其主要临床特征之一，是导致呼吸道高反应性及肺功能持续性、进行性损伤的主要原因，并可能导致顽固性哮喘〔1〕。氨茶碱作为治疗支气管哮喘的经典药物临床应用广泛，其药理研究多集中于抗炎、免疫调节的作用，对气道重塑的影响尚未见报道。本实验拟通过探讨氨茶碱对支气管哮喘大鼠支气管组织中凋亡相关蛋白Bcl?2、Bax含量的影响，进一步探讨氨茶碱对支气管哮喘气管重塑的防治作用。

　　1  材料与方法

　　1.1  实验动物 

　　清洁级SD大鼠24只，雌雄各半，体重180～220 g，由华中科技大学同济医学院实验动物学部提供，动物合格证号：SCXK（鄂） 2004?007。室温20℃饲养，自由进食水。

　　1.2  药物 

　　氨茶碱，天津金耀氨基酸有限公司产品，批准文号：国药准字H12020978。批号：20050917，250 mg，10 ml/支。

　　1.3  主要仪器及试剂 

　　彩云JWC?201D超声雾化器：鞍山市同信医用仪器厂产品。卵蛋白：美国Sigma公司产品。氢氧化铝：天津市化学试剂三厂生产，分析纯。NDY?1000彩色病理图像分析仪：武汉同济医科大学千屏影像科技公司生产。BH?2光学显微镜：Olympus公司生产。

　　1.4  动物分组及给药 

　　实验大鼠按随机表分为正常组、模型组、氨茶碱治疗组（简称治疗组），每组8只。治疗组从第1次哮喘激发开始灌胃给药，直至处死，2 ml每日1次，用药剂量按有关公式〔2〕，将人临床用药剂量折算为大鼠用药剂量，模型组、正常组均以2 ml生理盐水代替氨茶碱，每日1次灌胃。

　　1.5  模型建立 

　　实验组参照〔3〕，分别于第1天及第8天大鼠腹腔内注射新鲜配制的卵蛋白溶液1 ml（内含卵蛋白100 mg，氢氧化铝100 mg）致敏，第15天起哮喘模型组、治疗组开始雾化吸入1%卵蛋白激发哮喘，雾化流量5 ml/min，隔日1次，每次20 min，共4 w，以大鼠出现呼吸加快，口唇发绀，腹肌痉挛，点头呼吸及站立不稳等表现为激发成功。正常组以生理盐水代替卵蛋白进行腹腔注射及雾化吸入。

　　1.6  检测指标及方法

　　1.6.1  病理组织学观察 

　　10%水合氯醛3.5 ml/kg腹腔内注射麻醉，麻醉完全后开胸，迅速结扎右主支气管，取右肺中叶，4℃ 4%多聚甲醛固定，脱水、包埋、切片。HE染色,镜下观察病理学改变。采用NDY1000型图像分析仪测量大鼠气道壁面积、支气管平滑肌的面积，用完整支气管管腔的内周长（Pi）进行标准化。

　　1.6.2  支气管上皮及其周围组织中Bcl?2、Bax含量测定 

　　石蜡切片经二甲苯脱蜡及梯度酒精脱水，磷酸缓冲液（PBS）漂洗5 min×2次；3%的双氧水甲醇溶液室温孵育5～10 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，PBS洗涤3次；将切片浸入0.01 mol/L枸橼酸盐缓冲液(pH6.0)，微波炉加热至沸腾后断电，间隔5～10 min，反复1～2次，冷却后PBS洗涤2次，滴加5%正常山羊血清封闭，室温孵育20 min。倾去多余液体，滴加Bcl?2和BaxⅠ抗（1∶100稀释）湿盒孵育，4℃冰箱内过夜，PBS洗涤5 min× 2次；滴加生物素标记的二抗工作液，37℃孵育45 min，PBS 洗涤5 min×2次；滴加试剂过氧化物酶（SABC）（1∶100稀释）,37℃孵育20 min，PBS洗涤5 min×2次；二氨基联苯胺（DAB）显色5～15 min，终止呈色反应；苏木素衬染，常规裱片、干燥、脱水、透明、封片。光学显微镜下，Bcl?2和Bax蛋白染色呈棕黄色颗粒。Bcl?2蛋白测定：每张切片高倍镜下（×400）由同一观察者选取支气管上皮四周及左上共5个视野，计算机图像处理软件半定量测定支气管Bcl?2含量（以染色吸光度值表示）。Bax蛋白测定：每张切片高倍镜下（×400）由同一观察者选取支气管壁四周及左上共5个视野，计算机图像处理软件半定量测定支气管Bcl?2含量（以染色吸光度值表示）。

　1.7  统计学处理 

　　数据采用x±s表示，用Stata8.0统计软件处理，统计方法采用单因素方差分析及t检验。

　　2  结  果

　　2.1  支气管面积、支气管平滑肌面积的变化 

　　与正常组相比，哮喘激发4 w后模型组大鼠支气管壁面积、平滑肌面积明显增加，差异具有统计学意义（t=5.13，P=0.00,t=2.85，P=0.00)），治疗组大鼠支气管壁面积、平滑肌面积明显低于模型组，差异具有统计学意义（t=2.77，P=0.00,t=1.26，P=0.01）。见表1，图1。表1  各组大鼠气道形态学的比较 （略）

　　2.2  Bcl?2、Bax蛋白含量的变化 

　　与正常组相比，哮喘激发4 w后，模型组大鼠支气管?肺组织中Bcl?2、Bax蛋白含量明显增加，差异具有统计学意义（t=52.4，P=0.00,t=61.0，P=0.00）。与模型组相比，治疗组大鼠支气管上皮中凋亡相关蛋白Bcl?2含量明显高于模型组，差异具有统计学意义（t=28，P=0.009），支气管周围组织中Bax含量高于模型组，差异具有统计学意义（t=36.5，P=0.01）。见表2，图2。表2  气道重塑大鼠肺组织中Bcl?2、Bax含量的变化（略）

　　3  讨  论

    哮喘气管重塑本质上是机体对气管上皮慢性损害不完全修复的结果，Lee〔4〕等研究表明，上皮细胞损伤可诱发单核细胞浸润、上皮下组织纤维化，成纤维细胞和肌细胞的增殖等一系列致纤维化的反应。此过程涉及嗜酸性粒细胞、支气管上皮细胞、平滑肌细胞等多种因素参与，变态反应性炎症所导致的微环境改变可以导致气管多种细胞DNA合成增加以及细胞增生，从而导致气管重塑，减少支气管上皮细胞损伤，减少支气管内及周围炎症细胞及平滑肌细胞的数量可有效地抑制气道重塑〔5〕。近年的研究表明细胞的凋亡受多种基因的调控，其中Bcl?2，Bax被认为是抑制及促进细胞凋亡最重要的调控基因。
    本研究结果提示哮喘气道重塑过程中由于气道炎症导致气道上皮损伤，机体通过提高支气管上皮中Bcl?2含量从而抑制上皮细胞凋亡以对抗气道重塑；治疗组气道上皮细胞具有更好的抗凋亡能力，气道上皮的完整可防止由气道上皮损伤引起的气道重塑〔4〕。

    Bax基因位于19q13.3?13.4，由6个外显子组成，是重要的促凋亡基因，当Bax大量表达时，细胞对凋亡信号的反应增强，细胞凋亡增多，因此Bax被称为“死亡激动剂”。

    本实验提示正常情况下气道壁?肺组织细胞凋亡数量少，提示机体在气道重塑过程中通过加速气道壁?肺组织细胞（包括气道上皮基底膜细胞、平滑肌细胞及气道周围组织细胞）凋亡以抑制气道重塑。与模型组相比，治疗组支气管壁面积、支气管平滑肌面积均明显降低而Bax含量升高明显，提示治疗组较高的支气管壁?肺组织细胞凋亡可抑制气道重塑。

    应用氨茶碱治疗哮喘已有80多年的历史，口服或直肠给药吸收迅速，有效血药浓度为10～20 mg/L，理论上给予0.5 mg/kg氨茶碱可使血清药物浓度上升1 mg/L，其治疗剂量与中毒剂量十分接近，20 mg/L血药浓度即可出现中毒反应，血清药物浓度大于35 mg/l时可引起呼吸急促、惊厥甚至死亡〔6〕。本实验中原设置的高剂量氨茶碱（70 mg/kg）组实验动物，用药后呼吸兴奋、惊厥等中毒反应明显，并有数只在实验过程中死亡，无法进行统计处理。
    综上所述，氨茶碱具有较好的抑制支气管哮喘气道重塑的作用，其作用提高支气管上皮及支气管壁?肺组织中Bcl?2、Bax含量，减少气道上皮细胞的损伤，促进支气管壁?肺组织细胞凋亡的作用相关。

【参考文献】
  　　1 彭淑梅，赵建平，王淑珍，等.内皮素在儿童重度哮喘中的意义及作用〔J〕.广东医学，2002；23（2）：175?6.

　　2 陈 奇.中药药理研究方法学〔M〕.北京：人民卫生出版社，1993：33.

　　3 王文建，王 莉，杨西华，等.川芎嗪对大鼠支气管哮喘模型气道重塑的影响及机制〔J〕.中华结核和呼吸杂志，2004；27（12）:833?6 .

　　4 Lee CG,Cho SJ,Kang MG,et al.Early growth response gene 1?mediated apoptosis is essential for transforming growth factor beta l induced pulmonary fibrosis〔J〕.J Exp Med,2004；200(3):377?89.

　　5 孔祥永，栾 斌，郭 杰，等.实验性哮喘气道细胞DNA合成和气道重塑研究〔J〕.中国儿童保健杂志，2003；11（1）：39?41.

　　6 国家药典委员会；临床用药须知.中华人民共和国药典〔M〕.北京：人民卫生出版社，2005：244.