浅谈禽用疫苗安全性的检测方法
浅谈禽用疫苗安全性的检测方法
文/顾的乐 (新兴县温氏食品联营有限公司 )
【内容摘要】 ： 疫苗是一种特殊药品， 其质量优劣直接关系
到畜禽疾病预防的有效性和安全性， 也关系到对人类健康
和生态环境的影响。 因此对疫苗的生产、 经营和使用必须
有严格的监督管理和检测。
【关键词】:疫苗 安全 检测
疫苗 (Vaccine) 指的是由病原微生物、 寄生虫以及其组分或
代谢产物所制成的， 通过疫苗免疫是最有效的防控疫病措施之
一。
疫苗是一种特殊药品， 其质量优劣直接关系到畜禽疾病
预防的有效性和安全性， 也关系到对人类健康和生态环境的影
响。 因此对疫苗的生产、 经营和使用必须有严格的监督管理和
检测。 我国疫苗的检测是按照农业部颁布的 《兽医生物制品及
检验规程》 来进行， 疫苗的检测包括安全检验、 效力检验、 物理
性状检验等相关检验。 为了保证在养禽生产中使用安全高效的
禽用疫苗， 各养殖场须在疫苗使用前进行安全性检测。
目前， 禽用活疫苗外源病原检测项目有。
1 无菌检验或纯粹检验
1.1 无菌检验
厌氧性及需氧性细菌的检验用硫乙醇酸盐培养基 （T.G）
及酪胨琼脂 （G.A） ； 霉菌及腐生菌检验用葡萄糖蛋白胨培养基
（G.P） 。
1.2 灭活检验
用适于本菌生长的培养基或对本毒敏感的细胞、 组织和动
物。
1.3 检验方法及结果判定
（1） 含甲醛、 苯酚、 汞类等防腐剂和抗生素的制品用 T.G 培
养基 50ml， 接种样品 1ml （冻干制品先用 5ml 生理盐水稀释） ，
置 37℃培养，3 日后自小瓶中吸取培养物分别接种 T.G 小管
和 G.A 斜面各 2 支， 每支 0.2ml，1 支置 37℃ ,1 支置 25℃ ； 另
取 0.2ml 接种 1 支 G.P 小管置 25℃， 均培养 5 日， 应无菌生长。
（2） 细菌性活疫苗及不含防腐剂、 抗生素的其它制品或稀
释液将样品直接接种 T.G 小管和 G.A 斜面各 2 支， 每支 0.2ml，
1 支置 37℃ ,1 支置 25℃ ； 另取 0.2ml 接种 1 支 G.P 小管置
25℃， 均培养5日， 细菌性活疫苗应纯粹， 其他制品应无菌生长。
2 杂菌计数
2.1 样品稀释
随机抽取 3 瓶试验样品， 用酒精棉消毒瓶塞后加入 TSB
培养基对疫苗进行稀释， 最终使接种疫苗稀释液为 10 羽份
/0.3ml。
2.2 接种
取 10 块 GA 培养基平皿， 在平皿上做好标记， 每个样品接
种 3 个平皿， 每平皿接种 0.3ml， 倾斜平皿让接种物均匀分布
到琼脂表面， 设一阴性对照。 置 37℃培养箱培养 48h 后转移至
25℃培养箱内培养 24h。
2.3 计数
将培养结束的平皿取出， 分别计算杂菌数， 如果污染霉菌
亦作为杂菌计数。 根据平皿上的细菌数和霉菌数以及每块平皿
上接种的疫苗羽份数量， 用下面的公式计算每个样品每羽份所
含的杂菌数。
每羽份杂菌数 （杂菌数 / 份数）=
S1、S2、S3: 为第一、 二、 三块平皿杂菌数。D ： 为每块平
皿上接种的疫苗杂菌数。
2.4 结果判定
阴性对照平皿无菌生长， 实验有效。 任何一瓶待检样品每
羽份疫苗杂菌不超过 1 个为合格，3 个样品中任何一个样品每
羽份杂菌计数超过 1 个菌， 则该产品不合格。
3 外源病毒检验—鸡胚法
3.1 检测方法
（1） 鸡胚检测法分为 ： 绒毛尿囊膜接种 （CAM） 和尿囊腔接
种 (AS)。
（2） 鸡检查法 ： 用鸡胚检测无结果或可疑时， 可用鸡检 1
次， 检查临床反应及某些病原的抗体反应。
3.2 外源病毒检验时样品稀释的稀释与中和
每批疫苗取样 2 瓶， 将待检样品稀释成每毫升含 250 羽份
（1000羽份疫苗加入4ml无菌PBS溶液） ， 混合2瓶疫苗稀释液，
取出 1ml （250 羽份） ， 加入 3ml 相应的抗血清， 室温中和 1h， 接
种前再加入 1ml PBS 使总体积为 5ml。 如为联苗则需加入每种
抗血清各 2ml 中和 1h。
3.3 接种
鸡胚源疫苗与相应抗血清混合室温中和 1h 后， 取 9-11 日
龄 SPF 鸡胚 10 只， 通过 CAM 和 AS 2 个途径分别接种鸡胚 10
只， 每胚接种 0.2ml。 放置孵化机中孵化 7 天，24h 内死亡鸡胚
不计， 孵化 7 天后每组至少存活 8 个胚试验才有效。
3.4 结果判定
7 天后， 打开所有鸡胚 （包括 24h 后死亡鸡胚） 进行解剖观
察， 鸡胚发育正常， 绒毛尿囊膜无病变， 尿囊液 HA 为阴性。 则
检验样品合格。 如果因为外源病毒引起鸡胚死亡或病变， 则该
批疫苗不合格。
4 外源病毒检验—RT-PCR 检测方法
4.1RNA 的抽提
按照 RNA 抽提试剂盒说明书进行
4.2RT-PCR 反应液的配制
反应体系 ： 使用 TaKaRa PrimeScript One step RT-PCR Kit
Ver.2 （TaKaRa Code ： DRR055A）PCR 试剂盒， 反应体系为 25ul
体系， 具体如下 ： PrimeScript 1 Step Enzyme Mix 1ul ； 2×1 Step
Buffer 12.5ul ； S1、S2 各 1ul ； 模板 RNA 3ul ； Rnase Free 6.5ul。
4.3RT-PCR 反应程序
逆转录： 50℃ 30min； 预变性： 92℃ 4min； 扩增30个循环 （包
括 ： 变性 ： 94℃ 30sec ； 退火 ： 55℃ 30sec ； 延伸 ： 72℃ 45sec） ；
最后延伸 72℃ 10min。
4.4 琼脂糖凝胶电泳
（1） 用 1×TAE 缓冲液配制琼脂糖凝胶 ： 准确称取琼脂糖
1g， 加入 100ml 1×TAE 缓冲液。 在微波炉上加热至沸腾， 待冷
却至 60℃左右时， 加入 1ul Gold View， 摇匀 ； 将凝胶倒入预先
准备好的制胶板上， 置室温冷却待用。
（2） 取 PCR 产物 （5~10ul） 与 Loding Buffer 按使用比例混合
均匀后加至样品孔中， 其中一孔加入 Maker， 然后进行电泳， 电
压为 80V， 电泳时间约为 30~45min ； 取出凝胶在紫外灯下观察
结果。
目前， 国内禽用疫苗生产厂家的生产能力良莠不齐， 生产
疫苗所用的原料来源不清， 疫苗出厂时把关不严， 导致大量的
问题疫苗流入市场。 据中国兽医药品监察所 1996 ～ 2000 年对
666 批禽疫苗进行抽检， 合格率仅为 85％。 近年来， 我国一些鸡
群在免疫禽用活疫苗后发生了肿瘤病， 这是否与疫苗污染肿瘤
病毒有关， 特别是与制苗所用鸡胚受到外源病原的污染有关。
因此， 疫苗的安全性检测至关重要， 应引起各方的重视， 其检测
方法， 应在各养殖场广泛推广使用， 为防止问题疫苗流入市场，
杜绝问题疫苗造成养禽业的损失发挥应有的作用， 保证养禽业
稳步高效的发展。
【作者简介】 ：
顾的乐， 女，2001 年毕业于广东省新兴中药学校， 现就职
于新兴县温氏食品联营有限公司。
