兔角膜碱烧伤后LYVE-1的表达及意义

【摘要】  目的：研究探讨新西兰大白兔角膜碱烧伤后LYVE-1(淋巴管内皮透明质酸盐受体1)的表达及意义，进一步证实角膜新生淋巴管的存在，揭示其与角膜碱烧伤损伤修复的关系。方法：饲养24只健康新西兰大白兔，左眼制作角膜碱烧伤模型作为实验组，右眼不做手术作为对照组。术后1天、3天、7天、14天分别处死 6只兔，免疫组化测定两眼LYVE-1的表达情况。结果：实验组于术后第3天出现表达，第7天、第14天表达增加；实验组术后3天、7天和14天 LYVE-1表达均高于对照组。结论：角膜新生淋巴管在角膜碱烧伤中扮演重要角色。
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【关键词】  角膜碱烧伤；新生淋巴管；LYVE-1
   
　　Abstract  Objective:To examine the expression of LYVE-1 in the cornea of New Zealand rabbit undergoing alkali burn so as to confirm the onset of corneal neolymphangiogenesis as well as its correlation with post-burn corneal restoration. Methods: The left eyes of 24 healthy New Zealand rabbits were all subjected to alkali burn as the experimental group, while the untreated right eyes were chosen as the control group. Every six rabbits chosen randomly were killed at t=1 day, 3 day, 7 day and 14 day after operation respectively. The corneal expression of LYVE-1 was then examined through immunohistochemistry method. Result: LYVE-1 expression in the experimental group exhibits progressive increase starting from the third day after operation and reaches its peak presumably around the 7th day after operation. LYVE-1 expression in the experimental group exhibits much higher level than the control group at each time point (t=3 day, 7day and 14 day) examined. Conclusion: Corneal neolymphangiogenesis plays an important role in post-burn corneal restoration.
  
　　Key words  Corneal alkali burn; Neolymphangiogenesis;LYVE-1

　　角膜碱烧伤是临床上复杂而难以治愈的眼病之一,碱性物质既溶于水又溶于脂肪，因而进入细胞后，能迅速与细胞结构中的脂类发生皂化反应，故极易渗入眼组织深层，破坏眼内组织。本实验建立兔角膜碱烧伤的模型,通过免疫组化测定淋巴管内皮透明质酸盐受体1（LYVE-1)的表达，为进一步证实角膜碱烧伤后角膜新生淋巴管的存在提供有力的证据。

　　1  材料与方法
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　　1.1  动物及分组  选择内蒙古农业大学动物中心提供的3～4月龄健康新西兰大白兔24只，体重2～3kg，复合饲料喂养。将24只新西兰大白兔分为两组：左眼制作角膜碱烧伤模型作为实验组，右眼不做手术作为对照组

　　1.2  动物模型的制备  角膜碱烧伤模型的制作：用5mm圆形滤纸在1N的NaOH溶液中充分浸透，取出滤纸吸取溶液，贴于角膜中央烧灼30秒，移去滤纸后立即用无菌生理盐水冲洗结膜囊，以0.25%氯霉素滴眼。依Hughes分度法为中度碱烧伤模型。

　　1.3  免疫组化检查  将实验组及对照组术后1天、3天、7天、14天各组分别取6只兔的术眼及空白眼1/3膜（边缘带巩膜组织），浸入10%中性甲醛固定液中固定24小时，酒精梯度脱水，二甲苯透明，石蜡包埋，免疫组化测定LYVE-1值，阳性结果呈棕黄色背景无色或者淡黄色。

　　1.4  统计学方法  实验数据用x±s表示，使用SPSS13.0统计软件包，采用方差分析，α=0.05，P＜0.05为差异有统计学意义。
2  结果
  
　　每个标本做2张切片，每张切片随机取5个不同的高倍视野（×100），计算每个高倍镜视野的平均灰度值（平均灰度值与阳性表达程度成反比关系）。免疫组化阳性结果判定：胞浆内有黄色或棕黄色颗粒即为阳性表达部位。详见表1。

　　表1  不同时间不同组别大白兔LYVE-1的平均灰度值比较（略）

　　对照组兔的角膜几乎无明显的LYVE-1表达。实验组LYVE-1于术后第3天出现表达，第7天、第14天表达呈递增趋势，实验组内1天、3 天、7天比较，LYVE-1值差异有统计学意义（P＜0.01），7天和14天比较差异无统计学意义（P＞0.05）；实验组3天、7天、14天 LYVE-1表达均显著高于相对应的对照组，差异有统计学意义（P＜0.01）。
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　　3  讨论
  
　　眼部碱烧伤时，碱性物质进入眼内可与角膜蛋白结合形成碱化变性蛋白 [1]。正常角膜中无血管及淋巴管,以维持角膜的透明性和相对免疫赦免状态。但在角膜受到化学伤、热烧伤、感染、手术和佩戴角膜接触镜后,角膜缘的血管就可能长入角膜从而发生血管化，有关角膜新生血管在实验和临床研究均已得到证实，而关于角膜新生淋巴管(corneal lymphangiogenesis,CL)的研究由于一直缺乏特异性淋巴管标记物而未能得到开展。早在半个世纪前，Collin[2]在兔的CNV实验模型中，通过将墨汁注入到血管化角膜中而其最终流入眼局部淋巴结的实验和超微结构分析证明血管化角膜中存在新生淋巴管（corneal lymphangiogenesis,CL）。角膜新生淋巴管可以加速角膜的抗原运输和提呈[3],从而加快免疫应答的进程。LYVE-1是目前特异性最强的淋巴管内皮标志物之一，目前，国内有关大鼠角膜碱烧伤后新生淋巴管标记物VEGFR-3表达的研究仅有个别报道，但未见关于兔角膜碱烧伤后新生淋巴管标记物LYVE-1表达的研究报道。
  
　　本研究通过免疫组化染色法，检测淋巴内皮特异性标记物LYVE-1在角膜碱烧伤术后不同时间的表达情况，间接反映术后不同时间角膜新生淋巴管的情况。实验结果显示角膜碱烧伤组于第3天开始出现LYVE-1表达，第7、14天表达加强，说明角膜碱烧伤后于第3天出现新生淋巴管的表达，以后表达加强，揭示新生淋巴管出现于角膜碱烧伤的早期；LYVE-1在第7天和第14天表达无显著性差异，说明从第7天开始新生淋巴管没有再增多，细胞免疫反应进入稳定阶段。

【参考文献】
  　　[1] 刘春民,徐锦堂,赵松滨.角膜碱烧伤后机体巨噬细胞和淋巴细胞功能变化[J].国际眼科杂志,2002，2(4)：31-33.

　　[2] Collin HB. Corneal lymphatics in alloxan vascularized rabbit eyes[J].Invest Ophthalmol Vis Sc,1966,5：1-13.
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　　[3] Cursiefen C, KuchleM, Sorokin L,et al. Lymphatic vessels in vascularizedhuman corneas: immunohistochemical investigation using LYVE-1 andpodoplanin[J].Invest Ophthalmol Vis Sci,2002,43(7):2127-2135.

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