γ-氨基丁酸A受体在大鼠急性脑缺血中的变化

【摘要】  目的：观察大鼠大脑皮质γ-氨基丁酸A受体(γ-aminobutyric acid A receptors,GABAAR)在脑缺血不同时段的表达及其动态变化的规律，探讨其在急性脑缺血中变化的意义。方法：65只雄性Wistar大鼠随机分为对照组，脑缺血6 h组、12 h组、24 h组、3 d组、7 d组、14 d组(均为手术组)，假手术组;采用大鼠大脑中动脉栓塞(MCAO)模型，至规定时间点取大脑组织，行HE染色，用光学显微镜观察神经元损伤程度;用免疫组织化学技术判断神经元阳性表达的强弱;用形态分析系统检测各组GABAAR表达的阳性细胞数。结果：各手术组GABAAR表达均低于假手术组及对照组，与对照组相比，缺血6 h其表达既有降低，至12 h降至最低。而假手术组与对照组相比无统计学意义。结论：急性脑缺血可引起GABAAR表达下调，致使其对兴奋性氨基酸毒性的抑制作用减弱，这种下调和减弱程度与脑缺血的严重程度相一致，提示GABAAR在缺血性脑损伤中有神经保护作用,可能减缓了缺血性脑血管病的进程，同时GABAAR作为脑内最主要的一种抑制性氨基酸神经递质受体,除通过其配体门控性Cl-通道介导的效应对抗“兴奋毒性”作用外,GABAAR本身也因缺血所致理化因素的改变而发生变化。
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【关键词】  脑缺血;γ-氨基丁酸A受体;大鼠

　　Abstract　Objecive: To observe the expression of GABAAR and the dynamic regulation in the cortex of rats with focal cerebral ischemia in different phases and to investigate its significance in acute ischemia. Methods: Forty-eight male Wistar rats were randomly divided into 13 groups: The normal control, sham operation and ischemic operation group(subdivided into 6,12,24 hour and 3,7,14 days) by middle cerebral artery occlusion model. Brain specimens of the rats from each group were obtained for HE staining to observe the damage of neurons with light microscope and to judge the positive expression of neurons in immunohistochemistry technique, and then to determine the positive cell number expressed by GABAAR in each group with morphologic analysis system. Results: Compared with the normal control group and the sham operation group, the expression of GABAAR in each ischemia operation group was decreased 6h after ischemia and reached the bottom within 12 hours after ischemia. However, there was no significant difference between the normal control group and sham operation group. Conclusion: Acute cerebral ischemia can cause down-regulated expression of GABAAR and weaken its inhibitory action on glutamate excitotoxicity, which is accordant with the degree of cerebral ischemia injury, which suggests that GABAAR plays a role of nerve protection in cerebral ischemia injury and may slow down the progression of ischemic cerebrovascular disease, and that GABAAR, a major inhibitory neurotransmitter receptor of glutamate, undergoes some changes because of the physicochemical factors brought about by ischemia as it inhibits excitotoxicity through the action mediated by ligand gated chloride channel.
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　　Key words　Cerebral ischemia; Gamma-aminobutyric acid A receptors; Rats

　　脑缺血时,由于各类氨基酸大量释放,兴奋性氨基(exicitatoryamino acids,EAA)与抑制性氨基酸(inhibitory amino acids,IAA)间平衡被破坏,是导致神经元急性和迟发性“兴奋性毒性”损伤的关键因素。GABAA受体(GABAAR)作为脑内最主要的一种抑制性氨基酸神经递质受体,除通过其配体门控性Cl-通道介导的效应,对抗兴奋性氨基酸的兴奋性毒作用外,GABAAR本身也因缺血所致理化因素的改变而发生变化。

　　为了研究GABAA受体在脑缺血中的作用机制，我们在MCAO模型基础上，动态研究GABAAR在缺血性脑血管病中表达的变化，期待从分子水平揭示GABAAR在脑缺血中的作用机制。

　　1　材料与方法

　　1.1　实验动物及材料　健康Wistar雄性大鼠65只，体重260～310 g,由内蒙古大学动物试验中心提供。鼠抗兔GABAAR多克隆抗体购于美国麦莎公司;即用型SABC免疫组化染色试剂盒、抗体稀释液、DAB显色试剂盒、 PBS缓冲液、枸橼酸盐缓冲液、中性树胶均购于武汉博士德公司。
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　　1.2　实验方法

　　1.2.1　动物分组　将动物随机分为正常对照组(NC)，脑缺血后6 h组、12 h组、24 h组、3 d组、7 d组、14 d组(手术组，IG)及相对应时间点的假手术对照组(SOC),每组5只,共65只。

　　1.2.2　动物模型制备　采用右侧大脑中动脉线栓法(MCAO)，大鼠用10 %水合氯醛(0.3 mL/100 g)腹腔注射麻醉，取仰卧位固定于鼠台，碘伏消毒后颈部正中切口，暴露右颈总动脉和颈内、外动脉，结扎颈总动脉和颈外动脉近心端，血管夹夹闭颈内动脉，在近颈总动脉分叉处留置一条结扎线以便插线后固定鱼线。在颈总动脉近分叉处剪一约0.3 mm小口，将头部蘸有石蜡的鱼线(线直径0.26 mm,长50 mm)经小口处插入，沿颈内动脉入颅，进线深度由分叉处算约20 mm，稍感阻力时停止，此时已至大脑中动脉起始处，结扎用以固定鱼线的结扎线，剪去多余的栓线，缝合手术切口。假手术组除不插鱼线外，其余步骤同缺血组。

　　1.2.3　组织切片制备　分别在上述规定时间点，给予大鼠10 %水合氯醛0.5 mL腹腔注射麻醉，剪开胸腔经左心室快速输入0.9 %氯化钠注射液，同时剪开右心耳，待血色变淡后快速输入4 %多聚甲醛磷酸缓冲液固定脑组织，待鼠颈及四肢僵硬后停止灌注，快速断头取脑，自额极至枕叶分A、B、C、D、E 5等分，取C等分置于4 ℃ 4 %多聚甲醛磷酸缓冲液固定保存24 h,常规脱水、浸蜡、包埋，制成5 μm厚冠状切片。

　　1.2.4　光镜观察　取各组大鼠脑组织切片，经HE染色后，用光学显微镜观察神经元损伤程度;用免疫组织化学技术判断神经元阳性表达的强弱;用形态分析系统检测各组GABAAR表达的阳性细胞数。

　　1.2.5　免疫组化法检测　GABAAR采用链酶亲和素-生物素-过氧化物酶复合物法染色(SABC法)。如何发表论文

　　1.3　图像分析　采用江苏省捷达科技公司的形态分析系统进行图像分析，每张切片随机选出10个单位面积，测量免疫组化染色的阳性细胞数。

　　1.4　统计学分析　采用SPSS 10.0统计软件，各组数据均以均数±标准差(x±s)表示，两组间数据比较采用t检验，并进行方差齐性检验，P<0.05为差异有统计学意义。

　　2　结果

　　2.1　神经细胞病理形态学改变　光镜观察对照组、假手术组神经细胞形态结构正常、核圆淡染、核仁明显，未见组织坏死，见图1;手术组缺血灶内可见血管和神经元周围胶质成分肿胀，神经元呈三角形或杆状，胞核偏位并深染，有的甚至裂解、消失，见图2;脑缺血时间越长，细胞变化越明显，缺血重的组织内甚至可见液化性坏死灶，灶内神经元残存较少甚至缺失。

　　2.2　免疫组化结果　免疫组化阳性细胞信号呈棕黄色，在正常组织内GABAAR主要位于细胞膜和胞浆内，见图3;缺血后大脑皮质内 GABAAR阳性神经元显著减少，有些神经元胞浆内着色亦变淡，见图4。与相应时间点HE染色结果比较，发现GABAAR阳性神经细胞减少以缺血灶及其周围部位最为显著，在一些缺血严重的神经组织内看不到阳性神经元。另外，可见缺血灶内胶质成分呈颗粒状，背景染色较对照组浅。

　　与对照组相比，各时间点假手术对照组神经元阳性细胞数均无明显改变(P>0.05);与假手术组相比较，缺血组神经元阳性细胞数于脑缺血后6 h即有降低，12 h降至最低，故GABAAR表达于脑缺血后6 h即有明显降低(P<0.05),12 h降至最低。见表1。表1　各组GABAAR阳性细胞数的变化
3　讨论

　　GABAAR是中枢神经系统内主要的抑制性受体,参与了CNS的许多病理生理过程，但目前的研究并不深入。GABAAR功能障碍与多种神经和精神疾病，如脑缺血、癫痫、焦虑、抑郁、疼痛、老年痴呆等有关[1]。巴比妥类和苯二氮卓类(BZ)等药物作用于GABAAR能发挥其镇静、催眠、抗惊厥等药理作用[2]。

　　目前关于GABAAR在缺血性脑血管病病中的作用尚无定论。有资料报道GABAAR在缺血性脑损伤中表达下调，认为其发挥了保护作用;另一些则报道GABA受体的阻断剂具有部分神经保护作用,这表明抑制性递质受体的活动导致兴奋性毒性[3]。GABA受体是通过与GABA结合来实现中枢抑制作用,GABA可阻断Glu兴奋性毒性，抑制细胞膜去极化和Ca离子内流，具有神经保护作用[4-5]。在以往动物试验中,在卒中急性期应用γ-氨基丁酸类物质可减小卒中灶的体积而起到脑保护作用[6-7]。γ-氨基丁酸也参与了神经元损伤[8],并且与兴奋性氨基酸的兴奋毒性相关。二者比例的失衡可导致细胞功能持久或不可逆的改变。

　　1983年由Sigel等首次提纯并测定GABAAR序列后,目前通过cDNA克隆技术已鉴定了哺乳动物大脑中的18个GABAAR亚基,依据其氨基酸序列的相似程度,将亚基系列分为8个亚基族,分别命名为α1-6、β1-4、γ1-4、ρ1-3、δ、ε、π和θ[9]，其中γ2又有两种异构体,即长型γ2L和短型γ2S,从而构成GABAAR复合物的多样性和生理、药理特性的复杂性[10]。如何发表论文

　　目前的大量研究已表明GABAAR介导的生物效应在脑缺血性损伤的保护作用中起着重大作用。GABAAR是由膜蛋白组成的五聚体，由5个亚单位组成，这些膜蛋白控制GABA门控氯离子通道[11]。GABA作用于GABAAR上GABA位点，使神经细胞膜的氯离子通透性增加，由于细胞外氯离子浓度比细胞内氯离子浓度高，氯离子顺浓度梯度差进入细胞内，细胞内膜电位增大而产生超极化，从而介导了突触后膜抑制性突触后电位(inhibitory postsynaptic potential,IPSP)的产生,对谷氨酸等兴奋性氨基酸的“兴奋性毒性”作用具有直接的对抗作用。

　　我们在大鼠MCAO模型的基础上，揭示了脑缺血自然病程中GABAAR的变化过程。伤后不同时间脑切片HE染色对照表明，GABAAR弱阳性神经元多为缺血较重的神经元。提示在缺血性脑血管病的自然病程中，GABAAR参与了缺血性脑损伤的过程。我们的研究表明，正常组与各假手术组无差异，说明单纯的手术操作对GABAAR的表达无明显影响。 GABAAR在脑缺血后逐渐下降，缺血再灌注6 h后开始持续下调，12 h最为显著，这也说明GABAAR在继发性神经元损伤中可能发挥着重要的作用。结合以前的研究结果，即血液和脑脊液中的GABA在缺血性脑血管病中呈先升高后降低的双相变化，在缺血后GABA明显增高，再灌注后降低。Shimada等[11]报道再灌注早期GABA水平的升高可能是一种“保护性”反应，但有不少实验表明这种GABA增加可能导致GABA受体质量改变，引起其抑制效应衰减或兴奋性氨基酸释放，因而这种早期反应性增加仍不能对抗大脑皮质缺血性损伤。我们推测脑缺血时GABAAR数量出现的改变,可能与脑缺血损伤时细胞外液中GABA大量堆积，负反馈调控机体GABAAR表达的缘故,也可能是由于受体内移造成的。此外,尚有研究证实[12],选择性NMDA受体激动剂或拮抗剂也可调节GABAAR功能和亚单位的表达,因而推测脑缺血时细胞外液中高浓度的谷氨酸激动NMDA受体可能也参与GABAAR结构的变化[12]。至于迟发性GABAAR密度和分布的变化,则可能与脑缺血时神经元的降解有关。但目前我们没有足够的证据。若从上述GABAAR的改变机理来看，我们对谷氨酸兴奋性毒性的抑制除了集中在怎样去灭活生成过多的Glu及其生成途径上之外，还应关注在缺血再灌注损伤中GABA受体结构和功能的变化。特别是在目前各种氧自由基清除剂、谷氨酸受体阻滞剂和钙离子拮抗剂尚未取得较好临床疗效的前提下,开发和利用拟GABA类药物以及促进或恢复GABAAR功能的药物,对抗兴奋性氨基酸的兴奋毒性,可望成为一种抗脑缺血性损伤的新途径。

【参考文献】如何发表论文
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