EP2在海马齿状回突触传递中的作用
【摘要】 目的 探讨EP2在小鼠海马齿状回突触传递中的作用及其机制。方法 细胞外记录技术记录海马脑片穿通纤维-齿状回颗粒细胞突触的场兴奋性突触后电位(fEPSP)。结果 ①EP2的激动剂Butaprost增强海马齿状回突触传递和降低双脉冲比(paired-pulse ratio, PPR)，此效应被EP2的拮抗剂AH6809所阻断。②Forskolin单独或Forskolin+AH6809均可增强fEPSP的斜率。③EP2 增强突触效能的效应由PKA，ERK和IP3途径介导。结论 多信号转导途径可能参与EP2激活诱导的突触传递增强。代发表职称论文
【关键词】 前列腺素；环氧合酶-2(COX-2)；EP2；突触传递；海马
ChinaABSTRACT: Objective To evaluate the role of EP2 in synaptic transmission in dentate gyrus of hippocampus. Methods Field excitatory post-synaptic potentials (fEPSP) were recorded at the perforated path-granule neurons in dentate gyrus in vitro. Results ① Butaprost, an agonist of EP2, enhanced the synaptic transmission in dentate gyrus and decreased the paired-pulse ratio, and these effects were reversed by bath application of AH6809 (EP2 antagonist). ② Application of Forskolin alone or with AH6809 elevated the slope of fEPSP. ③ The Butaprost-induced responses were mediated via PKA, ERK and IP3 signal pathways. Conclusion Multiple signal pathways were involved in the EP2 activation-mediated enhancement of synaptic transmission.
KEY WORDS: prostaglandin; cyclooxygenase-2 (COX-2); EP2; synaptic transmission; hippocampus
环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)是转化花生四烯酸(arachidonic acid, AA)为不稳定的中间产物PGG2的限速酶[1-2]。COX-2参与兴奋性谷氨酸能神经传递和长时程突触可塑性[3-5]，并在神经源性炎症发生中起关键作用。前列腺素E2(prostagladin E2, PGE2)主要来源于COX-2氧化途径，研究表明PGE2是COX-2介导的突触效能变化的重要信使[3,6]。已经有4种PGE2的受体(PGE2 receptors, EPs)被鉴定和克隆，分别为EP1、EP2、EP3和EP4及EP3的多剪接异构体[5,7]。EPs属于7次跨膜结构的G蛋白藕联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)，这些EP受体亚型呈现明显不同的信号转导途径和细胞反应。EP1的激活增加细胞内Ca2+水平，并与Gq-PLC-IP3和蛋白激酶 C(protein kinase C, PKC)相藕联；EP3是与百日咳毒素敏感的Gi蛋白关联，导致cAMP生成减少，而EP2和EP4与Gs-cAMP-PKA途径相藕联引起cAMP增加 [5,7]。研究表明PGE2在调制突触活动的效能是通过激活突触前的EP2起作用的[8-9]，但EP2在突触传递中的作用还远未阐明。本研究拟探讨 EP2在海马齿状回穿通纤维-颗粒细胞突触传递中的作用及其信号转导机制。代发表职称论文
1 材料与方法
1.1 海马脑片准备
采用C57BL/6雄性小鼠，体重20～25g。海马脑片的制备如文献所述[3-4]。简言之，小鼠断头后将脑迅速置于0～4℃以950mL/L O2+50mL/L CO2混合气饱和的低Ca2+/高-Mg2+的切片用液(mmol/L)：2.5 KCl，7.0 MgCl2，28.0 NaHCO3，1.25 NaH2PO4，0.5 CaCl2，7.0葡萄糖，3.0丙酮酸，1.0抗坏血酸，234蔗糖。脑片被切成350μm厚的薄片，将其转移到含被氧饱和的人工脑脊液 (artificial cerebrospinal fluid, ACSF)的烧杯中进行孵育，ACSF的组成为(mmol/L)：125.0 NaCl, 2.5 KCl，1.0 MgCl2，25.0 NaHCO3，1.25 NaH2PO4，2.0 CaCl2，25.0葡萄糖，3.0丙酮酸，1.0抗坏血酸。在36℃孵育0.5～1h，然后置于室温(22～24℃)至少1.5h后可进行电生理记录。记录时将脑片转移至标本室，并在32～34℃连续地被950mL/L O2，50mL/L CO2饱和的ACSF灌流。在配有×60的入水镜头和直立式微分干涉相差显微镜 (Olympus BX51WI)下观察齿状回的颗粒细胞。随机抽取的每只小鼠制备的海马脑片取1～2片用于每组实验。用于每组实验的脑片为8～13片，对应的小鼠的数量是 5～8只，共计使用小鼠44只用于实验。
1.2 主要试剂
Butaprost(Buta)、AH6809(AH)、Forskolin(Forsk)、H89、PD98059(PD)及2-APB均购自Sigma。上述药物分别溶解于二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO；Sigma)，在临用前用ACSF分别稀释成所需浓度的工作液，工作液中DMSO的终浓度不超过1.4mmol/L。
1.3 电生理记录
使用Axoclamp-2B膜片钳放大器的桥式整流模式(bridge mode)在齿状回刺激穿通纤维，刺激频率0.05Hz，记录场兴奋性突触后电流(field excitatory post-synaptic potential, fEPSP)[4]。细胞外液组成为(mmol/L)：130.0 NaCl，2.5 KCl，1.0 MgCl2，10.0 HEPES，1.25 NaH2PO4，2.0 CaCl2，25.0葡萄糖(pH 7.4)。记录电极充灌ACSF(2～4MΩ)，置于齿状回的分子细胞层。取三分之一的fEPSP最大反应的刺激作为基线的刺激强度，双脉冲刺激 (paired-pulse stimulation)诱导的脉冲间隔为40ms。双脉冲比值(paired-pulse ratio, PPR)是第2个EPSP的幅值(P2)与第1个EPSP的幅值(P1)之比，即P2/P1。所有的浴槽灌流液均含有荷包牡丹碱(bicuculine, 10μmol/L)以阻断GABA受体介导的反应。代发表职称论文
1.4 统计学处理
所有数据以均数±标准误表示，均数间差异的显著性检验用Student?s t
-test及方差分析(ANOVA)，在需要时可结合学生Newman-Keuls检验进行统计学差异的比较。P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 EP2的激动剂Buta增强海马齿状回突触传递
为阐明EP2在海马齿状回突触传递中的作用，观察EP2激动剂Buta对fEPSP的影响。记录fEPSP至少10min作为基线，给予 Buta(5μmol/L)作用10min，然后用细胞外液冲洗30min至实验结束。Buta明显降低PPR，由用药前的1.32 ±0.054降低至用药后的1.09±0.035(6～10min)(P<0.01，图1A和1B)；而在AH存在的情况下，Buta在用药前后 PPR没有明显变化[(1.29±0.052)% vs. (1.25±0.048)%；P>0.05；图1A和1B]。Buta显著增强fEPSP的斜率[(153.92±5.72)%; n=13；P<0.01] (图1C)，且这一效应被EP2的拮抗剂AH(10μmol/L)所阻断[(100.80±3.08)%；n=12；图1C和1D] 。上述结果表明EP2增强突触传递的效应是通过突触前机制起作用的。
2.2 EP2拮抗剂AH对EP2的下游信号途径的影响
由于EP2与Gs-cAMP信号途径相藕联[5,8]，因此使用Forsk激活腺苷酸环化酶，观察Forsk单独或Forsk+AH对 fEPSP的影响。灌流Forsk(20μmol/L)引起fEPSP的斜率增加到(206.47±16.02)%(n=10，图2A和2B)，而在 AH(10μmol/L)存在的条件下，同样浓度的Forsk仍然可增强fEPSP的斜率到(217.23±20.38)%(n=8，图2B和2C)。结果提示cAMP是EP2作用的下游位点。代发表职称论文
2.3 EP2增强突触效能的效应由PKA、ERK和IP3途径介导
由于EP2与Gs-cAMP/PKA途径相藕联，因此，以浴液灌流PKA的抑制剂H89观察其能否阻断EP2的激动剂Buta的效应。在 H89(5μmol/L)存在的情况下，Buta(5μmol/L)增强突触效能的效应被显著抑制[Buta：(153.92±5.72)%, n=13；H89+Buta：(111.43±4.12)%, n=10; P<0.05](图3A)。
当分别给予ERK和IP3的抑制剂PD和2-APB，以确定这些信号转导途径是否参与了Buta介导的效应。如图3B、3C和3D所示，Buta(5μmol/L)所诱导的fEPSP斜率的增加分别被PD(20μmol/L)和2-APB(20μmol/L)完全阻断。结果表明ERK 和IP3信号途径参与了Buta诱导的效应。
3 讨 论
COX-2是催化AA转化为PGs的限速酶[1]，而PGE2是来源于COX-2氧化代谢途径的主要产物[5-6,8]。大量的研究表明COX-2和 PGE2参与突触传递和可塑性，COX-2调制海马的突触传递和可塑性是由PGE2介导的[3,6]。GPCRs的EP1-4在海马和皮层的神经元呈异源性表达[10]，且呈现明显不同的信号转导途径和细胞反应。EP1的激活增加细胞内Ca2+水平，并与Gq-PLC-IP3和蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)相藕联；EP3与百日咳毒素敏感的Gi蛋白关联，导致cAMP的生成减少，而EP2和EP4与Gs-cAMP-PKA途径相藕联引起cAMP增加 [5,7]。本研究的结果表明EP2受体的激活可增强突触传递，并且是通过突触前机制起作用。这与前人的研究PGE2在调制突触活动的效能是通过激活突触前的EP2起作用的观点相一致[8]。在视皮层抑制EP2基因可消除LTP的诱导[9]。
Forsk诱导的细胞内cAMP生成增加，无论有无EP2拮抗剂的存在，forsk均可增强突触传递，证明cAMP途径是EP2作用的下游位点。本研究也证实EP2的激动剂诱导的突触效能的增强是由PKA途径所介导。上述结果表明在海马齿状回EP2是通过cAMP/PKA途径起作用的。代发表职称论文
细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase, ERK)，p38 MAPK等与COX-2的表达和PGE2的产生有关。然而，关于EP2诱导的突触效能的变化是由哪些信号转导途径所介导还知之甚少。本研究表明ERK及 IP3信号转导途径参与了EP2介导的突触传递的增强。这说明多个信号途径介导了EP2诱导的突触效应。
【参考文献】
1]SIMMONS DL, BOTTING RM, HLA T. Cyclooxygenase isozymes: the biology of prostaglandin synthesis and inhibition [J]. Pharmacol Rev, 2004, 56(3):387-437.
[2]董西林，张勇，谢明. 环氧化酶-2及表皮生长因子受体在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义 [J]. 西安交通大学学报：医学版, 2007, 28(3):276-278.
[3]CHEN C, MAGEE JC, BAZAN NG. Cyclooxygenase-2 regulates prostaglandin E2 signaling in hippocampal long-term synaptic plasticity [J]. J Neurophysiol, 2002, 87(6):2851-2857.
[4]YANG H, ZHANG J, ANDREASSON K, et al. COX-2 oxidative metabolism of endocannabinoids augments hippocampal synaptic plasticity [J]. Mol Cell Neurosci, 2008, 37(4):6826-6895.
[5]YANG H, CHEN C. Cyclooxygenase-2 in synaptic signaling [J]. Curr Pharm Des, 2008, 14(14):1443-1451.
[6]CHEN C, BAZAN NG. Endogenous PGE2 regulates membrane excitability and synaptic transmission in hippocampal CA1 pyramidal neurons [J]. J Neurophysiol, 2005, 93(2):929-941.
[7]SUGIMOTO Y, NARUMIYA S. Prostaglandin E receptors [J]. J Biol Chem, 2007, 282(16):11613-11617.
[8]SANG N, ZHANG J, MARCHESELLI V, et al. Postsynaptically synthesized prostaglandin E2 (PGE2) modulates hippocampal synaptic transmission via a presynaptic PGE2 EP2 receptor [J]. J Neurosci, 2005, 25(43):9858-9870.
[9]AKANEYA Y, TSUMOTO T. Bidirectional trafficking of prostaglandin E2 receptors involved in long-term potentiation in visual cortex [J]. J Neurosci, 2006, 26(40):10209-10221.
[10]ZHU PM, GENC AI, ZHANG X, et al. Heterogeneous expression and regulation of hippocampal prostaglandin E2 receptors [J]. J Neurosci Res, 2005, 81(6):817-826.
【关键词】 前列腺素；环氧合酶-2(COX-2)；EP2；突触传递；海马
ChinaABSTRACT: Objective To evaluate the role of EP2 in synaptic transmission in dentate gyrus of hippocampus. Methods Field excitatory post-synaptic potentials (fEPSP) were recorded at the perforated path-granule neurons in dentate gyrus in vitro. Results ① Butaprost, an agonist of EP2, enhanced the synaptic transmission in dentate gyrus and decreased the paired-pulse ratio, and these effects were reversed by bath application of AH6809 (EP2 antagonist). ② Application of Forskolin alone or with AH6809 elevated the slope of fEPSP. ③ The Butaprost-induced responses were mediated via PKA, ERK and IP3 signal pathways. Conclusion Multiple signal pathways were involved in the EP2 activation-mediated enhancement of synaptic transmission.
KEY WORDS: prostaglandin; cyclooxygenase-2 (COX-2); EP2; synaptic transmission; hippocampus
环氧合酶-2(cyclooxygenase-2, COX-2)是转化花生四烯酸(arachidonic acid, AA)为不稳定的中间产物PGG2的限速酶[1-2]。COX-2参与兴奋性谷氨酸能神经传递和长时程突触可塑性[3-5]，并在神经源性炎症发生中起关键作用。前列腺素E2(prostagladin E2, PGE2)主要来源于COX-2氧化途径，研究表明PGE2是COX-2介导的突触效能变化的重要信使[3,6]。已经有4种PGE2的受体(PGE2 receptors, EPs)被鉴定和克隆，分别为EP1、EP2、EP3和EP4及EP3的多剪接异构体[5,7]。EPs属于7次跨膜结构的G蛋白藕联受体(G protein-coupled receptors, GPCRs)，这些EP受体亚型呈现明显不同的信号转导途径和细胞反应。EP1的激活增加细胞内Ca2+水平，并与Gq-PLC-IP3和蛋白激酶 C(protein kinase C, PKC)相藕联；EP3是与百日咳毒素敏感的Gi蛋白关联，导致cAMP生成减少，而EP2和EP4与Gs-cAMP-PKA途径相藕联引起cAMP增加 [5,7]。研究表明PGE2在调制突触活动的效能是通过激活突触前的EP2起作用的[8-9]，但EP2在突触传递中的作用还远未阐明。本研究拟探讨 EP2在海马齿状回穿通纤维-颗粒细胞突触传递中的作用及其信号转导机制。代发表职称论文
1 材料与方法
1.1 海马脑片准备
采用C57BL/6雄性小鼠，体重20～25g。海马脑片的制备如文献所述[3-4]。简言之，小鼠断头后将脑迅速置于0～4℃以950mL/L O2+50mL/L CO2混合气饱和的低Ca2+/高-Mg2+的切片用液(mmol/L)：2.5 KCl，7.0 MgCl2，28.0 NaHCO3，1.25 NaH2PO4，0.5 CaCl2，7.0葡萄糖，3.0丙酮酸，1.0抗坏血酸，234蔗糖。脑片被切成350μm厚的薄片，将其转移到含被氧饱和的人工脑脊液 (artificial cerebrospinal fluid, ACSF)的烧杯中进行孵育，ACSF的组成为(mmol/L)：125.0 NaCl, 2.5 KCl，1.0 MgCl2，25.0 NaHCO3，1.25 NaH2PO4，2.0 CaCl2，25.0葡萄糖，3.0丙酮酸，1.0抗坏血酸。在36℃孵育0.5～1h，然后置于室温(22～24℃)至少1.5h后可进行电生理记录。记录时将脑片转移至标本室，并在32～34℃连续地被950mL/L O2，50mL/L CO2饱和的ACSF灌流。在配有×60的入水镜头和直立式微分干涉相差显微镜 (Olympus BX51WI)下观察齿状回的颗粒细胞。随机抽取的每只小鼠制备的海马脑片取1～2片用于每组实验。用于每组实验的脑片为8～13片，对应的小鼠的数量是 5～8只，共计使用小鼠44只用于实验。
1.2 主要试剂
Butaprost(Buta)、AH6809(AH)、Forskolin(Forsk)、H89、PD98059(PD)及2-APB均购自Sigma。上述药物分别溶解于二甲亚砜(dimethylsulfoxide，DMSO；Sigma)，在临用前用ACSF分别稀释成所需浓度的工作液，工作液中DMSO的终浓度不超过1.4mmol/L。
1.3 电生理记录
使用Axoclamp-2B膜片钳放大器的桥式整流模式(bridge mode)在齿状回刺激穿通纤维，刺激频率0.05Hz，记录场兴奋性突触后电流(field excitatory post-synaptic potential, fEPSP)[4]。细胞外液组成为(mmol/L)：130.0 NaCl，2.5 KCl，1.0 MgCl2，10.0 HEPES，1.25 NaH2PO4，2.0 CaCl2，25.0葡萄糖(pH 7.4)。记录电极充灌ACSF(2～4MΩ)，置于齿状回的分子细胞层。取三分之一的fEPSP最大反应的刺激作为基线的刺激强度，双脉冲刺激 (paired-pulse stimulation)诱导的脉冲间隔为40ms。双脉冲比值(paired-pulse ratio, PPR)是第2个EPSP的幅值(P2)与第1个EPSP的幅值(P1)之比，即P2/P1。所有的浴槽灌流液均含有荷包牡丹碱(bicuculine, 10μmol/L)以阻断GABA受体介导的反应。代发表职称论文
1.4 统计学处理
所有数据以均数±标准误表示，均数间差异的显著性检验用Student?s t
-test及方差分析(ANOVA)，在需要时可结合学生Newman-Keuls检验进行统计学差异的比较。P<0.05为差异有显著性。
2 结 果
2.1 EP2的激动剂Buta增强海马齿状回突触传递
为阐明EP2在海马齿状回突触传递中的作用，观察EP2激动剂Buta对fEPSP的影响。记录fEPSP至少10min作为基线，给予 Buta(5μmol/L)作用10min，然后用细胞外液冲洗30min至实验结束。Buta明显降低PPR，由用药前的1.32 ±0.054降低至用药后的1.09±0.035(6～10min)(P<0.01，图1A和1B)；而在AH存在的情况下，Buta在用药前后 PPR没有明显变化[(1.29±0.052)% vs. (1.25±0.048)%；P>0.05；图1A和1B]。Buta显著增强fEPSP的斜率[(153.92±5.72)%; n=13；P<0.01] (图1C)，且这一效应被EP2的拮抗剂AH(10μmol/L)所阻断[(100.80±3.08)%；n=12；图1C和1D] 。上述结果表明EP2增强突触传递的效应是通过突触前机制起作用的。
2.2 EP2拮抗剂AH对EP2的下游信号途径的影响
由于EP2与Gs-cAMP信号途径相藕联[5,8]，因此使用Forsk激活腺苷酸环化酶，观察Forsk单独或Forsk+AH对 fEPSP的影响。灌流Forsk(20μmol/L)引起fEPSP的斜率增加到(206.47±16.02)%(n=10，图2A和2B)，而在 AH(10μmol/L)存在的条件下，同样浓度的Forsk仍然可增强fEPSP的斜率到(217.23±20.38)%(n=8，图2B和2C)。结果提示cAMP是EP2作用的下游位点。代发表职称论文
2.3 EP2增强突触效能的效应由PKA、ERK和IP3途径介导
由于EP2与Gs-cAMP/PKA途径相藕联，因此，以浴液灌流PKA的抑制剂H89观察其能否阻断EP2的激动剂Buta的效应。在 H89(5μmol/L)存在的情况下，Buta(5μmol/L)增强突触效能的效应被显著抑制[Buta：(153.92±5.72)%, n=13；H89+Buta：(111.43±4.12)%, n=10; P<0.05](图3A)。
当分别给予ERK和IP3的抑制剂PD和2-APB，以确定这些信号转导途径是否参与了Buta介导的效应。如图3B、3C和3D所示，Buta(5μmol/L)所诱导的fEPSP斜率的增加分别被PD(20μmol/L)和2-APB(20μmol/L)完全阻断。结果表明ERK 和IP3信号途径参与了Buta诱导的效应。
3 讨 论
COX-2是催化AA转化为PGs的限速酶[1]，而PGE2是来源于COX-2氧化代谢途径的主要产物[5-6,8]。大量的研究表明COX-2和 PGE2参与突触传递和可塑性，COX-2调制海马的突触传递和可塑性是由PGE2介导的[3,6]。GPCRs的EP1-4在海马和皮层的神经元呈异源性表达[10]，且呈现明显不同的信号转导途径和细胞反应。EP1的激活增加细胞内Ca2+水平，并与Gq-PLC-IP3和蛋白激酶C (protein kinase C, PKC)相藕联；EP3与百日咳毒素敏感的Gi蛋白关联，导致cAMP的生成减少，而EP2和EP4与Gs-cAMP-PKA途径相藕联引起cAMP增加 [5,7]。本研究的结果表明EP2受体的激活可增强突触传递，并且是通过突触前机制起作用。这与前人的研究PGE2在调制突触活动的效能是通过激活突触前的EP2起作用的观点相一致[8]。在视皮层抑制EP2基因可消除LTP的诱导[9]。
Forsk诱导的细胞内cAMP生成增加，无论有无EP2拮抗剂的存在，forsk均可增强突触传递，证明cAMP途径是EP2作用的下游位点。本研究也证实EP2的激动剂诱导的突触效能的增强是由PKA途径所介导。上述结果表明在海马齿状回EP2是通过cAMP/PKA途径起作用的。代发表职称论文
细胞外信号调节蛋白激酶(extracellular signal-regulated protein kinase, ERK)，p38 MAPK等与COX-2的表达和PGE2的产生有关。然而，关于EP2诱导的突触效能的变化是由哪些信号转导途径所介导还知之甚少。本研究表明ERK及 IP3信号转导途径参与了EP2介导的突触传递的增强。这说明多个信号途径介导了EP2诱导的突触效应。
【参考文献】
1]SIMMONS DL, BOTTING RM, HLA T. Cyclooxygenase isozymes: the biology of prostaglandin synthesis and inhibition [J]. Pharmacol Rev, 2004, 56(3):387-437.
[2]董西林，张勇，谢明. 环氧化酶-2及表皮生长因子受体在非小细胞肺癌组织中的表达及临床意义 [J]. 西安交通大学学报：医学版, 2007, 28(3):276-278.
[3]CHEN C, MAGEE JC, BAZAN NG. Cyclooxygenase-2 regulates prostaglandin E2 signaling in hippocampal long-term synaptic plasticity [J]. J Neurophysiol, 2002, 87(6):2851-2857.
[4]YANG H, ZHANG J, ANDREASSON K, et al. COX-2 oxidative metabolism of endocannabinoids augments hippocampal synaptic plasticity [J]. Mol Cell Neurosci, 2008, 37(4):6826-6895.
[5]YANG H, CHEN C. Cyclooxygenase-2 in synaptic signaling [J]. Curr Pharm Des, 2008, 14(14):1443-1451.
[6]CHEN C, BAZAN NG. Endogenous PGE2 regulates membrane excitability and synaptic transmission in hippocampal CA1 pyramidal neurons [J]. J Neurophysiol, 2005, 93(2):929-941.
[7]SUGIMOTO Y, NARUMIYA S. Prostaglandin E receptors [J]. J Biol Chem, 2007, 282(16):11613-11617.
[8]SANG N, ZHANG J, MARCHESELLI V, et al. Postsynaptically synthesized prostaglandin E2 (PGE2) modulates hippocampal synaptic transmission via a presynaptic PGE2 EP2 receptor [J]. J Neurosci, 2005, 25(43):9858-9870.
[9]AKANEYA Y, TSUMOTO T. Bidirectional trafficking of prostaglandin E2 receptors involved in long-term potentiation in visual cortex [J]. J Neurosci, 2006, 26(40):10209-10221.
[10]ZHU PM, GENC AI, ZHANG X, et al. Heterogeneous expression and regulation of hippocampal prostaglandin E2 receptors [J]. J Neurosci Res, 2005, 81(6):817-826.
