益肾调督针法对脑缺血再灌注大鼠TNF-α mRNA和蛋白表达的影响
【摘要】 目的通过观察益肾调督针法对脑缺血再灌注大鼠脑内 TNF-α mRNA和蛋白表达的影响，探讨益肾调督针法治疗缺血性脑损伤的机制。方法采用大鼠局灶性脑缺血再灌注模型，应用原位杂交及免疫组化方法观察脑缺血再灌注时TNF-α mRNA和蛋白表达的变化，以及针刺对其影响。结果正常组和假手术组大鼠TNF-α mRNA和蛋白在皮质区呈基础水平表达，脑缺血再灌注后 12 h TNF-α mRNA和蛋白表达增强(P<0.01)，针刺可明显抑制脑缺血区皮质TNF-α mRNA和蛋白的表达 (P<0.05或P<0.01)。结论益肾调督针法对缺血性脑损伤的保护作用机制与针刺抑制脑内TNF-αmRNA的表达从而减少TNF-α蛋白的合成有关。
【关键词】 益肾调督针法； 脑缺血； 再灌注； 肿瘤坏死因子-α
肿瘤坏死因子-α(TNF-α)作为一种多效性的促炎性细胞因子，不仅在机体炎症反应和损伤过程中起着重要作用，而且与缺血性脑血管病关系密切。本研究使用大鼠局灶脑缺血模型，观察益肾调督针法对脑缺血再灌注后不同时间点缺血侧皮质TNF-α mRNA和蛋白表达的影响，以探讨益肾调督针法抗脑缺血再灌注大鼠脑组织损伤的机制。
1 动物及分组
选用清洁级成年Wistar大鼠150只(广西中医学院实验动物中心提供)，体质量（240±20） g，雌雄各半，随机分为正常组、假手术组、模型组、益肾调督针法组和常规针法组各30只，其中每组又分为12，24 ，48 h等3个时间段组，每时段组各10只。其中，12 h针刺组于手术后1 h针刺，处死前再针刺1次；24，48 h针刺组一日针刺两次，处死前再针刺1次。
2 方法
2.1 动物模型的制备手术方法参照Zea Longa线栓法［1］加以改良。10%水合氯醛腹腔内注射麻醉后（35 mg/kg）,大鼠自主呼吸,手术过程中必要时追加麻醉药物。大鼠取仰卧位固定在手术台上,取左侧颈旁正中切口,钝性分离皮下组织,暴露并游离出颈总动脉、颈内动脉、颈外动脉,将颈外动脉主干缝扎后,然后将颈总动脉近心端结扎,颈内动脉用微动脉夹夹闭，在颈总动脉的近颈外动脉起始部剪一小口,将准备好经过处理的鱼线头端插入颈内动脉,松开微动脉夹,将鱼线缓缓上推,直至大脑中动脉入口处（约为1.8±0.5 cm），此时可感到栓线稍有阻力。在切口稍上方结扎,逐层缝合切口，栓线于皮肤外留5 cm左右，缺血1 h后抽取线栓,造成缺血再灌损伤模型。假手术组栓线不插入颈内动脉颅内段,其余操作同以上。待大鼠麻醉清醒后观察神经症状。
2.2 针刺方法及模型处理益肾调督针法组:取百会、风府、大椎、命门、肾俞(患侧) 、太溪(患侧) 。方法:手捻针,百会、风府、大椎用平补平泻手法,命门、肾俞、太溪用补法,留针30 min,每5 min行针1次。常规针法组：取合谷、曲池、环跳、足三里、昆仑，均取患侧，方法：手捻针，平补平泻手法,留针30 min，每5 min行针1次。空白对照组:不予任何处理。模型组:造成局灶性脑梗死模型不做针刺治疗。
2.3 取材各组大鼠行相应处理到规定的时间以10%水合氯醛足量麻醉，断头处死，于冰盘上取缺血侧脑皮层组织约200 mg分为两等份，分别用于检测TNF-α mRNA和蛋白，于-70℃冰箱保藏备用。
2.4 检测方法TNF-α mRNA和蛋白测定分别应用原为杂交和免疫组化的方法进行。试剂盒由武汉博士德生物工程有限公司提供，具体测定步骤严格按试剂盒说明书进行。应用北航图像分析系统，记数6个不重复高倍视野中阳性细胞数目，求平均值，用 ±s表示。
2.5 统计学处理应用SPSS16.0统计软件。计量资料以 ±s表示，多组样本均数比较采用方差分析。
3 结果
各组TNF-α mRNA和蛋白表达比较。
见表1～2。正常组与假手术组TNF-α mRNA和蛋白的阳性细胞数表达较低，二者相比无统计学意义（P>0.05）；模型组12 h皮质TNF-α mRNA和蛋白均开始表达，并且12 h TNF-α mRNA表达相对较高，以后开始逐渐下降，而蛋白表达的高峰稍延迟，出现于再灌注24，48 h后开始下降，与假手术组相比有统计学意义（P<0.01）；常规针法组和益肾调督针法组相应时间点TNF-α mRNA和蛋白表达的趋势和模型组相似，但在各时间点阳性细胞表达均较模型组降低，且有显著差异(P<0.05或P<0.01)。常规针法组与益肾调督针法组12 h相比有显著性差异(P<0.05)；常规针法组与益肾调督针法组24，48 h相比有极显著性差异(P<0.01)。表明缺血后脑组织中TNF-α mRNA和蛋白的表达均明显升高，针刺可降低脑组织中TNF-α mRNA和蛋白的表达，其中，益肾调督针法组的疗效要优于常规针法组。表1 不同时间点各组大鼠TNF-α mRNA表达阳性细胞数，表2 不同时间点各组大鼠TNF-α蛋白表达阳性细胞数(略)。
4 讨论 中风偏瘫, 病虽在肢节, 病源实在脑。“脑为元神之府”,“脑为髓海”,“诸髓者皆属于脑”,督脉统一身阳气，领一身气血,其起于胞中,下出会阴,沿脊内上行至项进入脑内，属脑,又有支脉络肾贯心。中风病瘀血痹阻经络时,脑之所属者督脉经气首当其冲,治疗时调督脉经气就显得尤为重要。通过调节督脉经气,经气通畅,又可调节肾气肾精,使肾生之髓,源源不断上注于脑,髓海充,则元神功能易于恢复。正如历代医家所言“病变在脑,首取督脉”。因此我们在临床推出“益肾调督针法”治疗中风,针百会、大椎、风府,以通督醒脑,调动五脏六腑之精气;取命门以通督益肾,敷布命门之火;太溪系肾经之原穴,配肾俞,可补肾生髓益脑。 【参考文献】
TNF-α是一种细胞起源 (分泌)的蛋白，属于一种前炎症细胞因子［2］，可引起在机体炎症启动维持和消退中都起着重要作用的其他因子的释放。多数研究表明，TNF-α在脑损伤后高度表达，并与脑损伤严重程度密切相关［3］。Wang等［4］认为在脑损伤后TNF-α mRNA的过度表达对组织损伤机制主要有以下几个方面：刺激细胞间黏附分子-1(ICAM-1)表达增高，致使白细胞滚动、附壁，阻塞微血管，导致微血管迟发性低灌注，并且破坏基底膜，浸润到组织发挥细胞毒性作用，继之脑水肿形成［5，6］。激活血管内皮细胞，使血管通透性增加，还可诱导血管内皮细胞产生凝血活性，使血栓烷A、血小板激活因子、凝血因子Ⅷ增加，同时抑制内皮细胞对抗凝血蛋白C旁路辅助因子的活性，从而使内皮细胞表面成为促凝状态，引发血栓和出血。影响血管舒缩活性物质的表达。触发细胞凋亡。
本实验结果表明，针刺组大鼠缺血侧皮质TNF-α mRNA和蛋白的表达均较模型组降低，差异具有显著性 ( P< 0. 05或P< 0. 01);益肾调督针法与常规针法均能够不同程度地降低实验大鼠脑组织中TNF-α mRNA和蛋白的表达，从而有利于保护脑缺血后神经元的进一步损伤,并且益肾调督针法疗效较常规针法更为显著。因此, 益肾调督针法对抗缺血再灌注脑组织神经元损伤的途径之一是通过抑制TNF-α mRNA的表达，减少TNF-α合成实现的。本研究还表明在缺血的早期脑组织TNF-α mRNA的表达升高，12 h达到高峰，在24 h时下降，而在TNF-α水平在损伤后24～48 h达到平台，表明脑缺血针灸介入治疗得越早，越能减少脑缺血对神经元的损害，从而改善脑缺血病人的预后。
［1］Zea Longa E, Weistein P R, Calson S, et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats［J］. Stroke, 1989, 20: 84.
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［4］Wang CX. Shuaib A. Involvement of inflammatory cytokines in central nervous system injury［J］. Pros Neurobiol, 2002， 67: 161.
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