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糖尿病免疫炎症问题研究

热度0票  浏览162次 时间:2011年7月18日 10:52

  要:本研究从Th亚群角度及CRP水平进一步应证了免疫炎症与2型糖尿病的发生有密切的关系,为2型糖尿病发病机制的研究提供了新的资料。目的:检测2型糖尿病患者外周血Th1/Th2淋巴细胞及血清高敏c-反应蛋白(hs-CRP)的水平,以探讨免疫炎症与2型糖尿病的关系。方法:运用三色荧光标记法流式细胞术检测外周血中Th1/Th2淋巴细胞,用ELISA法测定hs-crp。结果:①2型糖尿病患者Th1数,Th1/Th2比值与正常对照组相比明显降低(P<0.01),Th2数与正常对照组无明显差异。2型糖尿病患者外周血Th1淋巴细胞和HbA1c呈负相关关系(r=-0.688P<0.01)。②2型糖尿病患者血清hs-CRP与正常对照组相比明显升高(P<0.05)。糖尿病患者血清hs-CRP浓度与胰岛素敏感性指数呈显著负相关(r=-0.38P<0.01),与甘油三酯(r=0.33P< 0.05)、体重指数(r=0.42P<0.05)和空腹血糖(r=0.46P< 0.05)有正相关关系。结论:2型糖尿病患

者存在Th1/Th2淋巴细胞的失衡,血清hs-CRP水平与胰岛素抵抗程度有显著正相关,免疫炎症可能参与了2型糖尿病的发病。

关键词:2型糖尿病;Th细胞;高敏c-反应蛋白;免疫炎症;流式细胞术

 

  2型糖尿病患者存在细胞和体液免疫的异常已受到越来越多的关注,本研究通过测定外周血Th1Th2淋巴细胞及血清hs-CRP水平,旨在进一步明确免疫炎症与2型糖尿病的关系。

1  材料与方法

1)对象和材料

1)对象 

正常对照组25例,男12例,女13例,健康体检者,年龄(50.5±6.0)岁,汉族,无糖尿病及其它自身免疫性疾病。糖尿病组:新诊断的2型糖尿病患者60例,男32例,女28例,系本院内分泌科住院患者,年龄(52.9±9.7)岁, 44~78岁。入组患者均无糖尿病急慢性并发症,也无自身免疫性疾病、感染、肿瘤等。

2)试剂与仪器 

PERCP标记的抗CD4单抗,PE标记的抗IL-4单抗, PITC标记的抗IFN-γ单抗,(均为鼠抗人)。FITCPE PERCP标记的鼠IgG1同型对照免疫球蛋白、佛波醇乙酯(PMA)、离子霉素(Ionomycin),布雷菲德菌素ABFA)和Fix&Perm破膜剂均购自美国Caltag公司。hs-CRP试剂盒(晶美生物工程有限公司);胰岛素(INS)试剂盒(天津九鼎生物技术有限公司);流式细胞仪为美国Coul-ter公司EPICS-XL型。

2)方法

1Th1/Th2流式细胞术检测 

肝素抗凝血5ml淋巴细胞分离液分离单核细胞,将细胞数调整至1×106ml-1,将细胞悬液加入24孔细胞培养板中,加入刺激剂PMA20μg/ml),离子霉素(1μg /ml)和蛋白质转运抑制剂BFA2μg /ml)以阻止细胞因子向细胞外分泌。375% CO2环境下培养5小时,对细胞表面抗原进行染色,加入破膜剂进行固定-破膜打孔以利于细胞因子单抗进入细胞,进行细胞内细胞因子染色,每管加入10μl IFN-γ单抗和IL-4单抗,以相应的同种型对照IgG单抗作对照染色,应用流式细胞仪对分泌INF-γ的CD4+细胞Th1和分泌IL-4CD4+细胞Th2进行检测。

2)血清hs-CRP的测定

取晨起空腹静脉血2ml用双抗体夹心酶联免疫法(ELISA)测定。

3)血糖、胰岛素及相关指标的测定 

空腹10小时取晨血5 ml测定空腹血糖(FBG、葡萄糖氧化酶法)、空腹血清胰岛素(FINS放射免疫法)。HomaB胰岛素分泌指数=20×空腹胰岛素/(空腹血糖-3.5),是评价胰岛β细胞分泌功能的一个指标,胰岛素敏感性指数ISI=LN[1/空腹血糖(mmoL/L)×空腹胰岛素(mU/L]是评价胰岛素抵抗的一个指标。糖化血红蛋白(HbA1c),免疫分析法,德国Ba-yer公司DC2000HbA1c检测仪及检测试剂盒。

3)统计方法

 采用SPSS8.0统计软件包作统计学分析。资料均采用-x±s表示,组间比较用单因素

方差分析,以P<0.05为有统计学意义。相关分析用直线相关。

2  结果

12型糖尿病患者外周血Th1/Th2淋巴细胞与血清CRP及临床资料与正常组比较

2型糖尿病患者的Th1数,Th1/Th2比值较正常组显著下降(P<0.01),Th2数与正常组无明显差异。2型糖尿病患者血清CRP浓度显著高于正常对照组(P<0.05),HomaB较正常组显著下降(P<0.01)。

22型糖尿病患者外周血Th1/Th2淋巴细胞及血清CRP水平与胰岛素敏感性指数等相关性分析

相关分析显示,2型糖尿病患者外周血Th1淋巴细胞值与HbA1c具有明显的相关性(r=-0.68P<0.01),患者Th2Th1/Th2HbA1c之间无相关性(P>0.05)。Th2淋巴细胞值与HomaB具有明显的相关性(r=-0.54P<0.01)。2型糖尿病患者血清CRP水平与胰岛素敏感性指数呈显著负相关(r=-0.38P<0.01),与体重指数(r=0.42P<0.05),甘油三酯(r=0.33P<0.05),空腹血糖(r=0.46P<0.05)有显著正相关;与年龄和空腹胰岛素等无相关性。

3  讨论

近年来,越来越多的研究表明: 2型糖尿病存在着明显的细胞免疫和体液免疫异常。CD4+T辅助细胞(Th)是构成机体免疫系统的一种主要细胞,根据其分泌细胞因子的种类分为Th1Th2Th0三个亚群,Th1细胞主要负责细胞免疫应答、迟发性超敏反应(炎症反应)、Th2细胞与体液免疫有关,Th0Th1Th2细胞的前体细胞。生理条件下,机体的Th1细胞和Th2细胞处于相对平衡状态,在疾病状态下,这种平衡被打破,Th1Th2细胞所致不同优势免疫应答与疾病的发生,发展,预后有关。近来Th1/Th2细胞与糖尿病的关系日益受到关注,Katz等认为Th1细胞有可能促进1型糖尿病的发生,而Th2细胞对1型糖尿病有保护作用,Almawi等认为1型糖尿病是一种自身免疫性疾病,体液和细胞免疫均参与介导这一反应,Th1型细胞因子(IFN-γ、IL-2TNF-α)通过直接促进细胞调亡和(或)上调选择性粘附分子的表达,导致了β细胞的破坏。同时Th1型细胞因子还促进了自身反应性T细胞在胰腺的浸润,从而更加强了β细胞的破坏。目前对2型糖尿病这方面研究比较少。

本研究通过流式细胞分析技术检测细胞内细胞因子,发现新发的2型糖尿病患者的Th1数和Th1/Th2比值低于正常对照组,本研究还发现,2型糖尿病患者Th1值与糖化血红蛋白呈负相关,Th2淋巴细胞值与HomaB具有明显的负相关,提示Th1细胞劣势所致的细胞免疫缺陷可能引起了高血糖的发生,Th2淋巴细胞的升高导致了胰岛β细胞分泌功能的下降。虽然Th2与正常人比无差异,但Th1细胞亚群的改变导致了Th2亚群的变化,Th2型细胞因子促进B细胞活化,而产生过量IgG,也可促进杀伤性T淋巴细胞克隆的过度激活,该作用与其他细胞因子和效应分子产生的细胞毒作用结合,可以引起胰岛β细胞死亡,Th2细胞因子可能也通过体液免疫途径参与了2型糖尿病患者的发病。CRP是机体组织受到各种损伤或炎症刺激后肝脏产生的急性期蛋白,近来研究发现CRP在新发现的糖尿病或在已诊断的2型糖尿病患者中明显增高,而在非糖尿病或仅有空腹血糖异常者中正常。

本组资料选择无其它急慢性内外科疾患的新发的2型糖尿病患者作为研究对象,排除炎症、血压、冠心病等对CRP的影响,研究CRP2型糖尿病的关系。采用李光伟提出的胰岛素敏感性指数[ISI=1/(空腹血糖×空腹血胰岛素)]作为胰岛素抵抗程度的指标,发现2型糖尿病患者血清CRP浓度显著高于正常对照组(P<0.05)。提示2型糖尿病可能是细胞因子介导的炎症反应,炎症在糖尿病的发病机制起媒介作用。2型糖尿病组hs-CRPIAI有显著负相关(r=-0.38P<0.01),与体重指数(r=0.42P<0.05),甘油三酯(r=0.33P<0.05)和空腹血糖(r=0.46P<0.05)有显著正相关,提示2型糖尿病患者血清CRP水平与胰岛素抵抗密切相关,CRP水平是2型糖尿病存在胰岛素抵抗的预测因子。

研究认为胰岛素对于肝脏急性时相蛋白的合成具有不同的作用,可促进白蛋白的合成而抑制纤维蛋白原和CRP的合成,胰岛素抵抗时,胰岛素敏感性降低则会抑制胰岛素的生理作用,导致CRP合成的增加。但也有研究认为炎症反应、免疫激活以及相应的代谢变化均受到神经-内分泌激素的调节,并同时影响这些激素的功能,构成复杂的神经-内分泌-免疫网络。免疫系统激活产生的各种炎症因子(如IL-6TNF-α和CRP等)均能诱导胰岛素抵抗的发生。CRP水平的增高是胰岛素抵抗的诱因还是结果,有待进一步的阐明。

 

参考文献

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5 Katz JD BenoistCMathisD Tet al. helper cel



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