大蒜多糖对人体肝癌BEL-7402的体外抑制作用

【摘要】  目的探讨大蒜多糖(Garlic Polysaccharide，GP)对人肝癌BEL-7402细胞的增殖抑制效果和诱导凋亡的作用。方法以10，30，100，300 μg/ml 的 GP 作用于体外培养的BEL-7402 细胞，并作用不同时间，通过 MTT 法检测 GP 对细胞生长的抑制作用，倒置显微镜下观察细胞的形态变化，流式细胞仪检测细胞凋亡情况。结果MTT 实验显示 GP可抑制 BEL-7402 细胞的生长，呈时间及浓度依赖性,显微镜下可观察到细胞肿胀、破裂、呈坏死状,流式细胞仪可检测到 BEL-7402 细胞凋亡率明显增加。结论GP 能通过诱导细胞凋亡的方式有效地抑制人肝癌 BEL-7402 细胞的生长。

【关键词】  大蒜多糖; 肝癌细胞Bel-7402 ; 细胞凋亡

细胞凋亡作为生物细胞对内外信号刺激的一种反应，在正常细胞的发育过程中调控细胞的死亡过程，凋亡的产生可能由不同生理、生化或有毒物质诱发[1]。有研究认为肿瘤的发生是细胞凋亡被抑制的结果[2]。5-氟尿嘧啶(5-FU)作为当前临床上抗肿瘤药得到广泛应用，人们已认识到该药物可致免疫抑制作用和肝损害等毒副作用[3]，大蒜多糖(Garlic Polysaccharide，GP)是从大蒜球根中提取的活性成分，具有抗氧化、清除氧自由基、保护心肌、防止心肌纤维化作用[4，5]，但对诱导细胞凋亡的作用还见报道。本文通过研究 GP 对人肝癌细胞 BEL-7402 细胞生长的抑制以及诱导细胞凋亡的作用，旨在探讨 GP 体外对肝癌的作用效果，为其进一步应用于临床治疗肝癌提供有力的实验依据。

　　1 材料与仪器

　　1.1 药物GP的提取分离：新鲜大蒜去皮 → 碾成蒜泥 → 无水乙醇浸泡过夜→ 尼龙布过滤 → 沉淀用无水乙醇浸泡1 h → 尼龙布过滤 → 沉淀用无水乙醇浸泡24 h → 尼龙布过滤 → 沉淀(即脱脂蒜泥)用双蒸水溶解 → 沸水浴8 h → 冷却 → 尼龙布过滤 → 滤液中滴加4～5倍无水乙醇 → 静置72 h → 抽滤 → 滤液68 ℃水浴约8 h蒸出乙醇 → 滤液中滴加3 ～ 4倍丙酮 → 静置6 h → 抽滤 →得大蒜多糖组分C粗品。粗品Sevage法去蛋白后于55 ℃红外线干燥得淡黄色粉末即GP[6]。

　　1.2 细胞人肝癌细胞BEL-7402购自武汉大学医学院细胞中心。

　　1.3 试剂RPMI-1640干粉(美国Gibco公司产品);胎牛血清(杭州四季青公司);四甲基偶氮唑盐 ( MTT，sigma公司);二甲基亚砜(江苏强盛化工有限公司);注射用生理盐水(湖北拓朋药业有限公司);5-氟尿嘧啶(天津金耀氨基酸有限公司，批号：090271)。

　　1.4 仪器ALE-200型电子分析天平(湘仪天平仪器厂);YXJ-1型离心机(SIGMA); CO2 培养箱(HERAEUS);酶标仪(MAGELLAN);CKX41型倒置显微镜(OLYMPUS);流式细胞仪(FACS cadibur)。

　　2 方法

　　2.1 BEL-7402细胞培养人肝癌细胞BEL-7402常规培养于含10%热灭活的胎牛血清、100 U/ml青霉素、100U/ml链霉素的RPMI-1640培养液中，37℃，5%CO2及饱和湿度条件下培养，取对数生长期细胞进行各项实验。

　　2.2 MTT法测定取对数生长期的细胞消化，配制成1×105 个 / ml细胞悬液， 接种于96孔培养板中，每板300 μl。设4个浓度的药物组，一个阳性对照组和空白对照组，每组12复孔。药物组加不同浓度的GP使其终浓度分别为10，30，100，300 μg/ml ;阳性对照组加入5-氟尿嘧啶，使其终浓度为10 μg/ml。空白对照组为不加药物的培养基。置37 ℃，5 % CO2培养箱中分别培养24，48，72 h后每孔加MTT 20 μl，继续培养4 h后取出，吸弃培养基，每孔加150 μl DMSO，于酶标仪490 nm处测定其OD值，以正常组OD值为对照，计算各孔细胞抑制率(﹪)=(1-各孔OD值/正常组OD值均数)× 100%。

　　2.3 流式细胞仪检测正常培养基培养 24 h 后，加入RPMI-1640培养基及不同浓度GP(10，30，100，300 μg/ml)分别培养 24，48，72 h，收集细胞，以 PBS 清洗，加入1 μl annexin V-FITC，5 μl碘化丙啶(propidium iodide,PI)至细胞悬液中，轻轻摇匀，置冰浴中避光反应 10 min，加入400 μl预冷的10×binding buffer 至样品中，轻轻摇匀，在流式细胞分析仪上检测，每组计数 10 000 个细胞，检测凋亡细胞，其中凋亡细胞所占比例即为凋亡率(AR);分析处于不同周期的细胞比例。详细方法见参考文献[7，8]。

　　2.4 数据处理实验数据用±s 表示，组间比较采用t检验。

　3 结果

　　3.1 倒置显微镜细胞形态学改变 与空白对照组相比， GP作用于BEL-7402细胞24 h后部分细胞变圆，体积变小;48 h时细胞表面发芽，芽脱落后形成凋亡小体，细胞形态不规则，部分细胞肿胀、破裂;作用72 h，过半的细胞脱落，漂浮于培养基中，多数细胞肿胀、破裂，呈坏死状。

　　3.2 不同浓度GP作用后肿瘤细胞BEL-7402抑制率变化 实验结果表明，GP可抑制BEL-7402细胞增殖(P<0.01)，对BEL-7402细胞的抑制程度随剂量增加呈加大趋势，MTT测定细胞OD值与空白对照组有显著差异(P﹤0.01或P﹤0.05)。同一浓度下，GP对BEL-7402细胞的抑制程度随作用时间延长呈加大趋势，细胞OD值与空白对照组有显著差异(P﹤0.01或P﹤0.05)。见表1。

　　3.3 GP对BEL-7402细胞凋亡率变化结果显示不同浓度GP作用于人肝癌BEL-7402 24，48，72 h后，细胞凋亡率显著增加。见表2，图1。表1 GP不同浓度作用不同时间肿瘤细胞存活率表2 GP不同浓度作用不同时间后肿瘤细胞凋亡率

　　4 讨论

　　肿瘤的发生、发展与细胞凋亡异常有极密切的关系。许多抗肿瘤药物都可诱导或促进肿瘤细胞凋亡而发挥治疗作用[7]。细胞凋亡是由多基因调控的细胞主动死亡的过程，在生理性刺激或较弱的外界刺激作用下，细胞内部的遗传程序被启动，核酸内切酶被激活，通过一系列复杂的生化过程后出现非随机性DNA降解[9]。凋亡与肿瘤防治的关系是近年来的研究热点之一。普遍认为，对肿瘤细胞周期抑制和诱导凋亡是目前抗肿瘤药物主要作用机制之一。5-氟尿嘧啶是一种抗代谢药物，它主要通过抑制DNA合成中所需的叶酸、嘌呤、嘧啶及嘧啶核苷酸途径而抑制肿瘤细胞的生存和复制所需的代谢途径，从而导致肿瘤细胞的死亡。但该药首过效应严重，且治疗剂量与毒性剂量相近，毒副作用较强。因而寻找能诱导肿瘤细胞凋亡且毒副作用小的药物已成为开发抗肿瘤药物的新趋势。MTT比色分析法是根据活细胞能选择性地将四甲基偶氮唑盐还原成蓝黑色的甲膳沉淀物的原理而建立的测定活细胞的方法，该方法有灵敏度高、重复性好、操作简便、经济等特点，能反映细胞与药物的关系，便于实验室开展。流式细胞仪(FCM)通过单一或多种分析可以检测出细胞凋亡。在代谢、生化及分子水平上的表现可以对原代培养的神经细胞或已固定的细胞凋亡进行快速、方便、精确的定量分析，而且可以阐明细胞凋亡与细胞周期的关系，较电泳方法灵敏度更高[10]。本实验发现，大蒜多糖作用于肝癌细胞后，细胞凋亡率随大蒜多糖浓度的增大而增高，随作用时间的延长而增加。各实验组比对照组凋亡率高，且有统计学意义。各实验组之间相比较，诱导 72 h 较 24，48 h的凋亡率高。原因可能是在药物浓度达到一定量、且作用一定时间后，细胞开始凋亡，凋亡率随着药物浓度的增加和作用时间的延长而升高。本研究中，大蒜多糖表现出了良好的诱导肝癌细胞凋亡的效果，有望作为一种很有潜力的治疗肝癌药物，但其诱导凋亡的机理、是否引起肝癌细胞耐药及临床应用剂量和疗效方面还不十分清楚，有待于作深入全面的研究。

【参考文献】
  　[1] 单长明，胡娟娟，杜冠华.白英提取物诱导人肝癌BEL-7404细胞凋亡作用[J].中国临床药理学与治疗学，2001，6(3):200.

　　[2] Thompson CB. Apoptosis in the pathogenesis and treatment of disesse[J].Science,1995;267:1456.

　　[3] 刘 巍，冯威健，杨瑞合，等.羟基喜树碱、氨甲喋呤、5-氟尿嘧啶和醛氢叶酸联合化疗治疗晚期复发性乳腺癌[J].中国肿瘤临床，2000，27:821.

　　[4] 蔡 飞，陈金和，吴基良.大蒜多糖对小鼠病毒性心肌炎的治疗作用[J].武汉大学学报(医学版)，2003，24(2):109.

　　[5] 余 薇，王秀红，陈 凤，等.不同时期大蒜中多糖组分C的含量测定[J].时珍国医国药,2009,20(4):870.

　　[6] 余 薇，吴基良，汪 晖，等.大蒜多糖对阿霉素所致心肌细胞损伤的保护作用[J].中国药理学通报，2005，21(9):1104.

　　[7] Aguilar Lemarroy A,Kirchhoff S,Whitaker N,et al.Differential sensitivity of human papillomavirus type 16(+) and type 18(+) cervical Carcinoma cells to CD95-mediated apoptosis[J].Inj Cancer,2001,93(6):823.

　　[8] 韩 锐.抗癌药物研究与实验技术，第1版[M]. 北京:北京医科大学中国协和医科大学联合出版社,1997：116.

　　[9] 樊光华，姜 浩，欧文胜.人参皂甙-Rh2诱导人肝癌Bel-7404细胞凋亡的作用[J].实用癌症杂志,2003,18(1):16.

　　[10] 薛 红，黄 燕. 复方北芪口服液对大鼠大脑中动脉阻塞/缺血再灌流模型细胞凋亡的影响[J].现代中西医结合杂志，2004，13(13):1689.