安宫牛黄丸对脓毒症大鼠血浆内毒素水平的影响

【摘要】  目的探讨安宫牛黄丸对盲肠结扎穿孔（CLP）法所致脓毒症大鼠血浆内毒素水平的影响。方法取雄性SD大鼠90只，随机分为5组，分别为空白对照组、模型对照组、安宫牛黄丸低剂量组、中剂量组、高剂量组。各组动物于手术前禁食12 h，采用盲肠结扎穿孔法（CLP）复制脓毒症模型，中药组每只大鼠分别于术前0.5 h和术后6 h按1.0，2.0，3.0 g/kg的剂量灌胃安宫牛黄丸，空白对照组和模型组动物灌胃饮用水。于术后24 h，动物腹腔采血以终点显色鲎试验法测定血浆内毒素水平，另外取动物肺脏匀浆测定肺组织髓过氧化物酶（MPO）含量。结果模型组血浆内毒素水平明显高于空白对照组，而安宫牛黄丸低、中剂量组内毒素水平均显著低于模型组（P＜0.01）。模型组肺组织MPO含量明显高于空白对照组，而安宫牛黄丸低、中剂量组肺组织MPO含量均显著低于模型组（P＜0.05和P＜0.01）。结论安宫牛黄丸具有降低脓毒症大鼠血浆内毒素水平和肺脏MPO含量的作用，提示安宫牛黄丸对脓毒症具有一定的干预作用，为进一步探讨安宫牛黄丸治疗脓毒症的作用机理提供了药效学基础。

【关键词】  安宫牛黄丸； 脓毒症；盲肠结札穿孔； 内毒素； 髓过氧化酶； 鲎试验

  脓毒症（Sepsis）是严重创（烧）伤、休克、外科大手术后常见的并发症，是由各种致病性微生物（包括细菌、病毒、真菌等）侵入人体而引起的具有损伤性（引起多器官损伤）的激烈全身炎症反应，其本质上是一个失控的全身自我破坏性炎症反应过程［1］。脓毒症（旧称败血症）属于中医温热病范畴，是由于火毒炽盛、正气亏虚，正不胜邪、邪毒内陷，客入营血所致，热毒伏于血脉，弥漫三焦，内及脏腑，直犯神明，而成本病。安宫牛黄丸出自我国清代著名温病学家吴鞠通著作《温病条辨》，方由牛黄、犀角、黄连、黄芩、栀子、郁金、麝香、珍珠、朱砂、雄黄、冰片等11味中药组成，具有清热解毒、芳香辟秽、开窍通闭之功效，对温病有独特的疗效，是中医治疗温热病的温病“三宝”之一，也是中医危重病症急救要药。本实验根据安宫牛黄丸的主治功效，通过观察安宫牛黄丸对脓毒症大鼠血浆内毒素水平和肺组织髓过氧化酶（MPO）含量的影响，以揭示安宫牛黄丸对脓毒症的干预作用，为进一步探讨安宫牛黄丸治疗脓毒症的作用机理提供一定基础。

　　1  材料与方法

　　1.1  动物模型的制备健康雄性SD大鼠，体质量180～220 g。在Wichterman［2］报道方法的基础上进行改良，复制腹腔感染型脓毒血症。术前禁食12 h，用10﹪水合氯醛按15 ml/kg的剂量，腹腔注射麻醉大鼠，常规消毒腹部，在下腹部正中央切口，长约2 cm，打开腹腔寻找盲肠，小心分离其远端与大肠的系膜，盲肠内如有粪便，则把粪便小心挤向相连的大肠，寻找盲肠与小肠及大肠交界处，用灭菌4号丝线环形结扎，结扎完毕后应仔细检查，保持肠道通路正常。在与肠系膜相对的盲端肠壁浆膜面用9号针头穿刺两次，两个针孔相距约3 mm，第1针孔距盲端约3 mm，同时在第2针孔处放置一条宽2 mm的橡胶引流片，防止伤口愈合，轻轻将肠子放回原处，关闭腹腔，逐层缝合。术后即刻皮下注射生理盐水，补充手术过程中体液的丢失，剂量1 ml/100 g体质量。

　　1.2  动物分组与给药健康雄性SD大鼠90只，体质量180～220 g，购至广东省医学实验动物中心。将动物随机分为5组，分别为空白对照组（n=10）、模型对照组（n=20）、安宫牛黄丸低剂量组（n=20）、安宫牛黄丸中剂量组（n=20）和安宫牛黄丸高剂量组（n=20）。给药组每只大鼠分别于术前0.5 h和术后6 h按1.0，2.0，3.0 g/kg的剂量灌胃安宫牛黄丸，空白对照组和模型组动物灌胃等量饮用水。

　　1.3  标本的采集和处理无菌状态下腹主动脉采血，用肝素钠抗凝，3 000 r/min离心15 min，取血浆于-20℃保存。无菌状态下，取肺组织200 mg，加入1.8 ml生理盐水在冰浴下匀浆，3 000 r/min离心15  min，取上清液。

　　1.4  指标检测方法血浆内毒素检测采用鲎试剂合成基质偶氮显色法（试剂盒购于厦门市鲎试剂实验厂有限公司）；肺组织MPO活力检测采用酶学分光光度法测定（试剂盒购于南京建成生物工程研究所）。

　　1.5  统计学处理 应用SPSS11.5统计软件包进行统计分析，数据以±s表示，采用t检验和方差分析。

　　2  结果

　　2.1  安宫牛黄丸对大鼠血浆内毒素含量的影响与空白对照组比较，脓毒血症模型组动物血浆内毒素含量显著高于空白组（P＜0.01）。而安宫牛黄丸低剂量组和中剂量组血浆内毒素含量显著低于模型组（P＜0.01），安宫牛黄丸高剂量组虽然也有降低血浆内毒素含量的趋势，但与模型对照组比较没有显著性差异（P＞0.05）。结果见表1。表1  安宫牛黄丸对大鼠血浆内毒素含量的影响(略）

　　2.2  安宫牛黄丸对大鼠肺组织MPO活力的影响与空白对照组比较，脓毒血症模型组动物肺组织MPO活力显著高于空白对照组（P＜0.05）。而安宫牛黄丸低剂量组和中剂量组肺组织MPO活力显著低于模型组（P＜0.05和P＜0.01），安宫牛黄丸高剂量组虽然也有降低肺组织MPO活力的趋势，但与模型组比较没有显著性差异（P＞0.05）。结果见表2。表2  安宫牛黄丸对大鼠肺组织MPO活力的影响(略）

　　3  讨论

     脓毒血症是指各种致病微生物或其毒素存在于血液或组织中，是机体对感染的一种全身性炎症反应（SIRS），是严重感染、重度创伤、大手术后、重型急性胰腺炎和休克等常见的并发症，进一步发展可导致感染性休克、急性呼吸窘迫综合征（ARDS）和多器官功能障碍综合征（MODS）［3］。

  内毒素是革兰氏阴性菌的细胞壁的主要成分。研究表明，内毒素是脓毒症的主要触发剂［4］。目前研究认为，细菌因子在脓毒症的致病过程中起了非常重要的作用，SIRS是脓毒症的重要生理病理变化［5］。内毒素其主要化学成分为脂多糖（LPS）是革兰氏阴性菌细胞壁的主要成分。内毒素的生物学效应主要表现为介导作用，它可在细菌繁殖过程中或菌体破裂后分泌出来，巨噬细胞、内皮细胞、单核细胞、平滑肌细胞和嗜中性细胞是内毒素的靶细胞，在被激活后释放内源性介质如细胞因子等。细胞因子在细胞内的主要功能是改变基因表达，其方式有4种：激活“沉默”基因、上调基因表达、下调基因表达和关闭基因表达，从而调节炎性反应。LPS激活巨噬细胞，释放3种介质即蛋白质、反应性氧基和脂质。蛋白质包括TNF-α，INF-α，IL-1，IL-6，IL-8，IL-12等。LPS的生物效应能被TNF-α所模拟，可认为TNF-α是内毒素血症的主要细胞因子。在低浓度时，TNF-α具有防御感染的作用，是白细胞和内皮细胞活性和功能的调节者。高浓度时，如在SIRS和脓毒血症病人，起有害作用可引起脓毒症性休克。TNF-α受体的表达非常广泛，几乎出现于所有的细胞上。IL-1和1L-6也可由TNF-α诱导产生，是强有力的内源性致热源。内毒素引起的O+2、OH-和NO能提高巨噬细胞和中性白细胞的杀菌能力，但也引起过度的炎性反应。内皮细胞来源的NO是强有力的血管扩张剂，当产生过量时会导致休克的发生和发展。巨噬细胞受LPS刺激时，多种脂类介质释放出来。例如：血小板激活因子（PAF）、PGE2、白三烯C4等，这些脂类介质参与了ARDS的形成，而后者经常伴有脓毒症的发生［6］。在本实验中，脓毒血症模型组大鼠血浆内毒素的含量与空白对照组比较显著增高（P＜0.01），这有利于证实内毒素可能是脓毒血症的触发剂。而安宫牛黄丸低剂量、中剂量组与模型组比较，其血浆内毒素含量显著降低（P＜0.01），这说明安宫牛黄丸能够减少脓毒血症动物内毒素的释放，为进一步探讨安宫牛黄丸治疗脓毒血症的机制奠定了一定的基础。

    髓过氧化物酶［7，8］（MPO）是中性粒细胞（PMN）特有的还原酶，它主要存在于PMN的嗜天青颗粒中，且每个细胞所含酶的量是恒定的，约占细胞干重5％，故可以通过组织MPO活性来定量测定PMN的数目，肺组织中MPO活性高低可定量反映PMN扣押与聚集的程度。导致实验性脓毒症大鼠肺组织中便有PMN浸润，应与肺脏特殊的解剖学和生理学特点有关，因为肺脏不仅是一个重要的代谢器官，同时又是全身静脉血液的滤过器官，各组织脏器所产生并释放到血液中的代谢产物、活性物质都要从肺脏经过，且肺脏毛细血管分支较少，血管长，灌注压低，血流缓慢，流经肺毛细血管活化的PMN易与内皮细胞接触并粘附，在粘附后不易被缓慢的血流冲走，因此PMN易于聚集于肺脏。而肺组织活化的中性粒细胞经脱颗粒作用，释放弹性蛋白酶、髓过氧化物酶和金属酶等多种蛋白酶，分解胞外纤维与基质，可导致肺组织损伤［9］。因此髓过氧化物酶活性的高低在一定程度上可以反映肺组织的损伤程度，从实验结果显示，安宫牛黄丸低、中剂量可以降低肺组织髓过氧化物酶的活性，在一定程度上减轻脓毒症对肺组织的损伤。

    本实验结果显示，安宫牛黄丸能够降低脓毒症大鼠血浆内毒素水平，同时能够降低脓毒症肺组织中MPO的活性，这说明安宫牛黄丸对脓毒症大鼠具有一定的干预作用，为进一步探讨安宫牛黄丸治疗脓毒症的作用机理提供了一定的基础。

【参考文献】
  　［1］Levy MM,Fink MP,Marshall JC,et al.2001 SCCM/ESICM/ACCP/ATS/SIS international Sepsis Definitions Conference［J］.Crit Care Med，2003，31:1250.

　　［2］Wichterman KA.Sepsis and septic shock:a review of laboratory methods and a proposal［J ］.Surg Res，1980，29:189.

　　［3］任成山.脓毒症的发病机制［J］.中国急救医学，2005，25(10):748.

　　［4］Heithan TH,Bruce CK,Dabid WM,et al.Post-injury multiple organ failure;the role of the gut［J］.shock,2001,15:1.

　　［5］Jones GR.The systematic inflamatory response syndrome as a predictor of bacteria and outcome from sepsis［J］.Q J Med,1997,89:515.

　　［6］Adrie C.The inflammatory balance in human sepsis［J］.Intens Care Med,2000,26:364.

　　［7］王明海，张又胜，赵国海.等.实验性大鼠重症急性胰腺炎早期肺组织MDA、MPO的变化［J］.皖南医学院学报，2006，25(2):81.

　　［8］王世锋，王文波，牛 嘉.高压氧暴露对小鼠肺组织匀浆髓过氧化物酶活性的影响［J］.海军医学杂志，2005，26(2):102.

　　［9］Hiroyuki Y,Alex B,William G,et al.Enhanced pulmonary expression of CXC chemokines during hepatic ischemia/reperfusion-induced lung injury in mice［J］.J Sur Res，1999，81(1):33.