艾炷灸对D-半乳糖衰老小鼠大脑组织形态和超微结构的影响
【摘要】 目的观察艾炷灸对脑组织形态和超微结构的影响。方法将健康3月龄昆明雄性小鼠按随机区组设计分为：造模组、生理组、艾灸1组、艾灸2组、电针组、尼莫地平组6组，每组各12只。另设自然衰老组（16月龄）昆明雄性小鼠12只。造模组、艾灸1，2组、电针组、尼莫地平组，连续42 d颈背部皮下注射D－半乳糖造成小鼠衰老模型；生理盐水组连续42 d颈背部皮下注射等量生理盐水，12 d后艾灸1，2组，分别选取小鼠“足三里、悬钟”，“关元、百会”行艾柱灸治疗，电针组取“足三里、悬钟”治疗，尼莫地平组给予尼莫地平灌胃，均为隔日1次，共15次。采用光镜观察脑组织形态学变化和神经元密度，电镜下观察脑组织超微结构。结果①生理组大脑皮层、海马CA3区细胞结构正常。模型组、自然衰老组可见皮层、海马CA3区变薄，大部分神经元变性，胞核与胞浆界限模糊，核固缩，核仁消失。艾灸1，2组、电针组和尼莫地平组仍有不同程度的神经细胞变性，但变性神经细胞数量显著减少。②各组小鼠脑皮质及海马CA3区神经元密度差异有显著性意义（P<0.01），模型组、自然衰老组与生理组、艾灸1，2组、电针组、尼莫地平组神经元密度比较差异有显著性意义（P<0.01），模型组、自然衰老组神经元细胞密度下降。③大脑皮质超微结构，生理组神经细胞结构清晰，胞浆较宽，细胞器丰富，核仁清楚。模型组和自衰组神经元细胞变性，凋亡细胞器减少。其他各治疗组超微结构损伤较模型组和自衰组减轻。结论艾炷灸“足三里、悬钟”，“关元、百会”可减轻D-半乳糖造成的氧化损伤，保护脑组织形态及其神经元细胞超微结构。
【关键词】 艾炷灸； D-半乳糖； 病理形态； 超微结构
随着年龄的增长，大脑神经细胞数量减少，突起萎缩，大脑为首的中枢神经系统会出现健忘、反应迟钝、动作不协调等脑萎缩症状，甚至丧失社会活动能力、生活不能自理的老年痴呆的证候。祖国医学称为“髓海不足”。《灵枢·海论》早有明确记载：“髓海有余，则轻劲多力，自过其度”,“髓海不足，则脑转耳鸣，胫酸眩冒，目无所见，懈怠安卧。”清代汪昂的《本草备要》亦述：“人之记性均在脑中，小儿善忘者，脑未满也，老年健忘者，脑渐空也。”历代医家都重视艾炷灸防治疾病，延年益寿，故有“保健灸”“长寿灸”之说。目前临床研究证实针灸对脑萎缩、老年性痴呆等有较好的疗效［1，2］。本文从大脑组织形态和超微结构的变化探讨艾炷灸延缓脑衰老的作用机制。
1 材料与仪器
1.1 动物健康3月龄昆明雄性小鼠。体质量（30±2）g，80只。另购置老年前期（16月龄）昆明雄性小鼠12只。均由广西医科大学动物中心SPF实验室提供（动物许可证号：SCXK桂2003-0003）。
1.2 艾灸用品精制艾绒为苏州东方艾绒厂提供。
1.3 仪器和试剂奥林巴斯生物显微摄影系统（BX60 PM20 型，日本）；全自动轮转式组织切片机（HM355S 型，MICROM德国）；Matic Images Advanced 3.2病理图文分析系统(Motic China Group Co.,Ltd.)；JEM100CX-II透射电镜。D-半乳糖为国药集团化学试剂有限公司提供；尼莫地平片为山西亚宝药业集团股份有限公司提供；0.9%生理盐水为广西中医学院一附院制剂室提供； 4%多聚甲醛、戊二醛（上海国药集团化学试剂有限公司）；1%锇酸、丙酮、环氧树脂812+815、醋酸铀、枸橼酸铅（北京大学医学部病理学系制备）。
2 方法
2.1 动物分组用Morris水迷宫筛选游泳距离不低于2 600 cm/2 min、体质量不低于28 g的72只健康雄性小鼠。按随机区组设计将72只小鼠分为：造模组、生理组、艾灸1，2组、电针组、尼莫地平组6组，每组各12只。16月龄昆明雄性小鼠12只为自然衰老组（简称自衰组）。
2.2 造模方法参照文献［3］用D-半乳糖颈背部皮下注射，建立亚急性衰老小鼠模型。将D-半乳糖试剂与生理盐水按1.2（g）：100（ml）混匀为（12 mg/ml），造模组、艾灸1，2组、电针组、尼莫地平组每天以D－半乳糖按120 mg/kg/d颈背部皮下注射（相当于每10 g体重注射0.1 ml浓度为1.2%的D－半乳糖溶液），连续42 d，同时对生理组颈背部皮下注射等量的生理盐水42 d。
2.3 治疗方法造模第13天开始治疗,艾灸1组选取小鼠“足三里、悬钟”，艾灸2组选用“百会、关元”进行艾柱灸治疗，时间选择上午9:00～11:30，选取小鼠双侧“足三里”（先灸）、“悬钟”（后灸），及“百会”（先灸）、“关元”（后灸），灸后用棉签轻轻按压穴位。每次3壮/穴。定位取穴按照《实验针灸学》［4］和《实验动物针灸手册》［5］，“足三里”在膝关节下方，腓骨小头下3 mm处的肌沟中；“悬钟”在后肢外踝尖直上5 mm腓骨后缘处,“百会”在顶骨正中处，“关元”脐下正中线1 cm处。穴位选定后剪毛，施灸时涂凡士林以保护小鼠皮肤且便于固定艾炷，艾炷做得紧而结实(底座直径2 mm，高度5 mm,重量约13～15 mg)，用线香点燃，每壮时间约18～20 s，当小鼠挣扎时更换艾炷。电针组将输出电流正极接足三里，负极接悬钟，用20Hz连续波，电流0.24～0.3 Am以小鼠肢体轻微抖动，不嘶叫为度，3 min/次。尼莫地平灌胃组剂量按体表面积等效折算计算法，予12 mg/(kg·d)，灌胃。治疗方法均为隔天1次，共15次。生理组和造模组、自衰组不做任何治疗性干预，但给予与各治疗组同样时间、同等程度的绑缚刺激。
2.4 样本制备将小鼠断头处死，于冰浴上取左侧大脑额叶皮质处组织2～3 mm3投入3%戊二醛固定3 h以上，送检。剩余的于4%多聚甲醛固定，石蜡包埋。所有组织蜡块4 μm连续切片4张置60℃烤箱烤干。另取自衰组（相当人60岁）［6］小鼠6只，断头处死，标本处理同前述。
2.5 指标检测HE染色，光镜下观察形态学变化并摄片。采用Matic Images Advanced 3.2病理图文系统分析，在显微镜下于每张病理切片皮层和海马两个部位，分别选取不相重叠的12～6个视野，计数完整的神经细胞数，其与视域参考面积(3 951.316～1 975.66 μm2)的比值(单位面积神经元数)即是神经元密度。
电镜下总体观察大脑皮层神经组织超微结构变化：神经细胞、胶质细胞、髓鞘、轴索及血管病变。
2.6 统计方法统计数据用SPSS 13.0软件包处理，各组完整大脑皮质、海马神经元密度用±s,进行多个样本均数的方差分析以及组间两两比较（LSD检验和SNK-q检验）。统计结果见表1。表1 大脑皮质、海马CA3神经元密度（略）
与模型组和自然衰老组比较，1)P<0.01；与尼莫地平组比较，2)P<0.01，3)P<0.05；与模型组比较，4)P<0.05
3 结果 3.1 D-半乳糖衰老小鼠脑组织病理形态学改变脑组织常规石蜡切片，HE染色后，神经细胞胞浆呈紫红色，核呈紫蓝色。①生理组皮层脑细胞结构正常，胞核清晰，胞浆丰富，间质无水肿表现，海马CA3区锥体细胞2～3层，排列紧密，细胞核圆而大，核仁清晰(见图1～2)。模型组、自衰组可见皮层变薄，部分神经元变性，体积变小，胞核与胞浆界限模糊，核固缩成三角形或不规则形，核仁消失。海马CA3区锥体细胞层数减少，排列稀疏、不规则，细胞体积变小，可见核固缩现象（见图3～6）。艾灸1组、艾灸2组、电针组和尼莫地平组仍有不同程度的神经细胞变性，但变性神经细胞数量显著减少，零星可见部分损伤细胞，海马CA3区锥体细胞层细胞形态、排列基本正常（见图7～14）。②经单因素方差分析组间比较各组小鼠脑皮质及海马CA3区正常神经细胞的数目差异有显著性意义（P<0.01），并作组间两两比较。（见表1）。生理组、艾灸1组、艾灸2组、电针组、尼莫地平组与模型组、自然衰老组神经元密度比较差异有显著性意义（P<0.01），模型组神经元细胞密度下降。自然衰老小鼠大脑皮质神经元密度与模型组无差异，但在海马CA3区自然衰老组神经元密度较模型组减少明显，差异有显著性意义（P<0.05），提示模型组脑组织形态改变与自然衰老小鼠相似。生理组、艾灸组、电针组之间神经元密度无差异，尼莫地平组与前3组比较在皮质区神经元密度差异有显著性意义（P<0.01或P<0.05），在海马区仅与生理组神经元密度差异有显著性意义（P<0.05）。 3.2 大脑皮层神经组织超微结构变化①生理组组织结构较好，神经细胞结构清晰，细胞为锥体形或多边形，胞浆较宽，细胞器丰富，可见较多的线粒体、粗面内质网、高尔基体、核糖体等，核染色质疏松，核仁清楚及少量吞噬溶酶体。未见明显水肿等其他变化。轴索结构清楚，微丝微管丰富，排列整齐（见图15）。②模型组神经细胞有变性，变性细胞程度不一，少数神经细胞轻度变性，但普遍程度较重。线粒体数量增多、增大或空泡变性，线粒体脊模糊，核糖体脱落。轴索肿胀空泡化，微丝微管数量减少，排列散乱。部分髓鞘结构松解或脱失，出现较多的吞噬溶酶体（脂褐素）。部分小血管内皮细胞有变性，血管周隙扩大，星形细胞空泡变性或溶酶体增多，足突破坏较明显（见图16）。③艾灸1组组织结构清楚，大部分神经细胞结构较好，少部分神经细胞有空泡变性，线粒体基质较致密。轴索空泡化，微丝数量减少，排列散乱。部分髓鞘结构松解或脱失，出现吞噬溶酶体。部分小血管内皮细胞有变性（见图17）。④艾灸2组组织结构清楚，大部分神经细胞结构较好，轻度空泡变性，部分神经细胞基质及线粒体基质较致密，出现较多的溶酶体结构。核染色质轻度溶解。轴索轻度空泡化，微丝数量减少，排列较散乱，出现较多的溶酶体。部分小血管内皮细胞空泡变性，星形细胞尚可（见图18）。⑤电针组组织结构清楚，大部分神经细胞结构较好，糖原较多，部分神经细胞糖原增多，轻度空泡化，或基质轻度致密，出现较多的溶酶体结构。核染色质轻度溶解。部分轴索空泡化，微丝数量减少，髓鞘结构松解或脱失，出现较多的溶酶体。部分小血管内皮细胞及星形细胞空泡变性（见图19）。⑥尼莫地平组组织结构清楚，大部分神经细胞结构较好，细胞器及糖原较多，部分神经细胞空泡化，或基质轻度致密，出现较多的溶酶体结构，偶见神经细胞皱缩，呈暗细胞表现。部分轴索空泡化或微管聚集，髓鞘结构松解。部分小血管内皮细胞变性，星形细胞空泡变性，足突破坏（见图20）。⑦衰老组细胞凋亡，核膜凹陷，细胞核肿胀，胞浆空泡化，脂褐素增多，胞浆细胞器减少，线粒体结构不清，粗面内质网轻度扩张，有脱粒现象。部分轴索空泡化或微管聚集，髓鞘结构松解（见图21）。 依病变程度从重到轻排序：衰老组，模型组，尼莫地平组，艾灸2组，电针组和艾灸1组，生理组。 4 讨论 在动物和人类的研究中都观察到随着年龄的增加，大脑皮质、海马、基底节、小脑、脑干及丘脑和下丘脑等区都存在神经元数目减少的现象和趋势。神经元数目的减少是脑老化过程的重要事件［7］。无论在正常老化还是老年性痴呆,其病理改变主要见于海马和大脑皮质。其中海马又是最易受衰老影响的脑区之一。大量研究己证明海马与学习记忆特别是空间认知功能有关，尤其CA3区被认为与空间辨别性学习记忆活动的关系尤为密切［8］。由于海马与学习记忆关系密切以及海马对衰老的易感,许多学者将海马作为脑衰老研究的理想模型。脑组织是高耗能器官，线粒体既是细胞的供能站，也是氧自由基浓度最高的细胞器，D-半乳糖处理的动物，活性氧水平升高，脂质过氧化亢进［9］，体内超氧阴离子自由基反应，发生蛋白质交联，髓鞘变性等，使得线粒体的蛋白质、脂质、DNA损伤，随着时间的积累，这些损伤使氧化产物进一步增多，清除机制有限，导致脑老化。有学者［10，11］证实D-半乳糖处理小鼠海马神经元细胞凋亡，皮层神经元转录水平降低，RNA，蛋白质含量下降，神经细胞数目减少，提示D－半乳糖衰老小鼠模型出现神经元结构和脑功能减退，发生老化倾向，老龄动物的结果吻合。 本实验也证实D－半乳糖衰老小鼠模型出现大脑皮质和海马CA3区锥体细胞的神经元细胞密度下降，核固缩、变性。与18月龄的自然衰老小鼠大脑皮质和海马CA3区神经元密度变化相似。本研究进一步观察了D-半乳糖处理动物的超微结构，模型组神经元细胞变性，核膜不规整，细胞早期凋亡。胞浆中，线粒体肿胀、空泡变性，线粒体脊模糊，粗面内质网排列紊乱,核糖体脱落。出现较多的吞噬溶酶体（脂褐素）。微丝微管数量减少，排列散乱，髓鞘结构松解或脱失，与18月龄衰老小鼠相似。有学者也在衰老的人脑组织中观察到相似的情况［12］，认为自由基损伤是细胞衰老的主要原因，细胞内脂褐素的沉积正是细胞膜系统发生过氧化反应的产物。脂褐素在细胞内积聚到一定程度,会造成核糖核酸的损害,最终将影响细胞的代谢，导致细胞死亡。老年脑中还可见到神经纤维缠结,其形成与痴呆程度相关,而构成神经纤维缠结的螺旋状缠绕纤维可能由神经微丝微管演变而来,是一种变异了的微丝蛋白,这种异常的细胞骨架成分可能会导致神经元的死亡。模型组微丝微管排列散乱，是否会进一步形成老年脑中病理特征的神经纤维缠结有待深入研究。本研究中生理组神经细胞结构清晰，细胞器丰富，结构完整，见少量吞噬溶酶体，微丝微管丰富，排列整齐。各治疗组神经元细胞有不同程度的变性损伤，但较模型组与衰老组轻。通过艾炷灸、电针、尼莫地平灌胃的干预治疗可以提高D-半乳糖衰老小鼠模型大脑皮质和海马CA3区神经元细胞的密度，减少神经元细胞的变性、凋亡，减轻D-半乳糖造成的氧化损伤，保护D-半乳糖衰老小鼠神经元细胞的超微结构，延缓脑老化。 本研究结果表明艾炷灸、电针足三里、悬钟穴和艾炷灸百会、关元穴这两组处方都通过脾肾双补，补益髓海。足三里为阳土经土穴，土生万物，以后天补养先天之精；“胆主骨所生病”，悬钟为胆经穴位，八会穴之髓会，故悬钟可治髓所生病,且精血相生，乙癸（肝肾）同源，而肝胆两脏互为表里，胆属阳，阴阳相长，足三里、悬钟二穴配合属远道循经取穴，激发经气，气至病所，故可助精填髓。百会属督脉，为髓海之气转输之处，有近治作用；关元为元阴元阳关藏之处，足三阴与任脉之交会，能补肝、脾、肾三脏，有远道调整作用，二穴配合能使局部和整体功效相结合，补脾肾充髓海，使衰老的髓海得以补养。“以火补者，毋吹其火”艾炷灸因其操作待其自灭，更换艾炷，故以补为主，对防治老年病有一定的优势。研究结果艾炷灸与电针疗法比较差异无显著性意义，但艾炷灸疗法操作较为方便、无疼痛，更易为患者接受。 【参考文献】
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