抑郁症大鼠海马区树突形态变化研究
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发布者：lunwenchina
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时间：2018年8月31日 13:46
摘要： 目的：抑郁症大鼠海马 3 Ammon 角区（cornu ammonis 3 CA3）神经元树突分支、长度及树突棘密度动态变化观察。
方法：利用敞箱实验(open- field test)作行为学评分，评分相近大鼠随机分为正常对照组（C 组）和抑郁组（D 组），每组60 只。对照组正常饲养，抑郁组采用慢性轻度不可预见性应激(CUMS)法给予处理，分别在 7d、 14d、 21d、 28d 随机挑选 10只用敞箱实验做行为学评分并于当日处死做高尔基染色分析树突分支、长度及树突棘密度变化。结果：正常对照组大鼠各时间点敞箱实验评分无明显差别(P<0.05)，树突分支、长度及树突棘密度无明显变化(P<0.05)；从 14d 开始，与对照组相比抑郁组大鼠敞箱实验评分减小(P<0.05)，树突分支、长度及树突棘密度明显减少(P<0.05)。结论：随着抑郁程度的加重，大鼠海马 CA3 区神经元树突分支、长度及树突棘密度逐渐减少。
关键词： 抑郁症；海马；树突形态
中图分类号： R561 文献标识码： A 文章编号： 1671-5837(2018)05-0217-03Dendritic morphology of neurons in hippocampal of depression ratsSUN Yan,LI Huan-li,et al.(The stroke cener of ZhouKou centre hospital,ZhouKou City,Henan Province,China )Abstract: Objective To discuss the dendritic morphology changes of pyramidal neurons in hippocampal cornu ammonis 3（CA3） ofdepressed rats. Methods Rats were randomly divided into normal control group and depression group according to open-field test and60 rats in each group.Depression group was dealt with chronic unpredictable mild stress (CUMS) while control group breedingnormally. 10 rats were selected randomly from each group after 7d, 14d and 21d and 28d for open-field test and Golgi staining.ResultsCompared with control group,open-field test scores of depression group was significantly reduced((P <0.05))and dendritic branching,length and dendritic spine density was significantly decreased (P <0.05) at each observation point after 14d.Conclusion As thedevelopment of depression,dendritic branches,length and density of dendritic spines gradually reduced in hippocampal CA3 of rats.
Keywords: Depression hippocampus dendritic morphology抑郁症是以行为出现异常表现，心境低落为主要症状的一种心身疾病。抑郁症会对人体的消化、免疫及神经系统等机能产生影响甚至造成损伤，再鉴于该病的高发病率、难治愈和高复发率等特点，抑郁症给社会和个人带来了极其严重的负担。关于抑郁的发病机制有很多种假说，诸如“神经递质机制”、“神经内分泌及神经免疫机制”、“神经营养因子与成年神经再生机制”以及“表观遗传学机制”，然而诸多假说都围绕着“神经可塑性”这一关键点展开。抑郁症患者的情绪障碍可能与前额叶皮质的背外侧部结构改变有关，患者常表现为皮层和边缘系统异常功能偶联[1]。海马是边缘系统的重要组成部分，与情绪、学习和记忆, 以及免疫等功能相关， CA3 区是对应激极度敏感的亚区[2]。慢性不可预见性应激会导致抑郁样行为发生，引起海马脑源性神经营养因子（ Brain-derived neurotrophic factor ， BDNF)表达降低,一氧化氮合酶（ NOS）表达升高[3]。 BDNF 是脑内含量最多的神经营养因子，它可以促进发育中的中枢神经系统神经元的分化与成熟[4]，也可以促进成熟神经元树突的生长和轴突分支的形成[5]。因此，我们推测，抑郁症大鼠海马 CA3 区神经元树突分支及树突棘密度应该有相应变化，然而关于其变化的规律国内外还未见报道。
本实验采用国际公认的慢性轻度不可预见性应激(CUMS)法制作大鼠抑郁模型，采用敞箱实验(open-field test)评价实验大鼠抑郁行为，快速灌注 Golgi 染色法观察树突分支及树突棘密度的变化。
1 资料与方法
1.1 实验地点
试验完成于郑州大学第一附属医院重点实验室
1.2 实验动物分组
成年 SD 雄性大鼠 120 只(郑州大学实验动物中心提供) ,体重 180～200g,在自由饮食、光/ 暗周期为 12hr/ 12hr (光照时间 600～1800hr) 、背景噪音为 40± 10db、温度 20± 3℃条件下饲养 1 周以适应环境。利用敞箱实验(open- fieldtest)作行为学评分,敞箱实验水平运动和垂直运动总得分低于 30 分和高于 120 分的动物予以剔除，选择评分相近的动物,随机分为正常对照组（ C 组）和抑郁组（ D 组），每组60 只。对照组动物 5 只/笼、抑郁组动物 1 只/ 笼饲养。
1.3 抑郁大鼠模型建立
抑郁组大鼠按照 Katz 的方法略加改进,将明暗颠倒 24h、4 ℃冰水游泳、停水 24h、停食 24h、夹尾 1min、 30v 电压电击足底 5s、水平震荡 5min(160Hz) 、 40 ℃环境 5min 共九种刺激随机安排到 27 日内,每日一种,每种刺激出现 3 次,同种刺激不能连续出现,使动物不能预料刺激的发生。对照组不予任何刺激,上述各组处理均至第 27d,在实验第 0、 7、14、 21、 27d 利用敞箱实验(open-field test)评价动物行为学变化。分别在第 8d、 15d、 22d、 28d,即末次处理 24h 后,每组随机挑选 5 只大鼠进行快速灌注的高尔基染色进行树突棘形态分析。
1.4 高尔基染色、树突长度及树突棘密度分析
将到达观察点的各组大鼠进行快速灌注 Golgi 染色，用振荡切片机经海马冠状位连续切片（切片厚度 130?m),制片，光镜下观察。在每只大鼠的切片中，选择海马 CA3 区背景清晰且被染出的锥体神经元密度均匀的 5 张切片，每张切片测量 4 个形态完整的细胞，每组各时点共选取 200 个细胞进行观察。采用 Shall 插件对树突的分支及长度进行统计， 400倍显微镜下以神经元胞体为圆心，做间距为 20?m 的同心圆，统计树突与同心圆的交点数之和，用交点总数反映树突的分支和长度。在 1000 倍油镜下观察树突棘，从胞体发出的树突第 1 次分支开始，计算 30-50?m 长度范围内树突棘的个数，以每 20?m 树突棘个数反映其密度。
1.5 统计学分析
采用 SPSS17.0 软件进行统计学处理，所有数据均采用均数±标准差（ ± s）表示。首先进行数据的正态性检验和方差齐性检验，采用单因素方差分析和 LSD 法进行两两比较， P<0． 05 差异有统计学意义。
2 实验结果
2.1 慢性轻度不可预见性应激对大鼠行为的影响如表 1 所示，各组的基线垂直运动和水平运动得分无明显差异（ p﹥ 0.1）。 14d 的 CUMS 后，抑郁症模型组的垂直运动得分和水平运动得分都显著低于正常对照组（ p﹤ 0.01 和p﹤ 0.05） ,21d 和 28d 的 CUMS 后，抑郁症模型组的垂直运动宋体黑体 得分和水平运动得分都显著低于正常对照组（ p﹤ 0.01）。
表 1 各组大鼠敞箱实验行为学评分（ ± s， n=10）0d 7d 14d 21d 28dC 组垂 直 运 动 得 分22.55± 5.3122.36± 7.2420.63± 5.6321.08± 6.0620.73± 5.26水 平 运 动 得 分54.63± 14.1251.53± 15.3849.55± 12.3054.43± 11.1253.12± 11.54D 组垂 直 运 动 得 分20.42± 4.5418.23± 3.5614.86± 7.97●10.67± 5.43●8.32± 6.02●水 平 运 动 得 分58.86± 16.3351.23± 16.6942.66± 17.64▲43.24± 18.11●29.00± 15.67●注：与对照组相比● p﹤ 0.01,▲p﹤ 0.05。
2.2 慢性轻度不可预见性应激对大鼠海马区锥体细胞形态的影响2.2.1 高尔基染色结果
图 a 海马区大锥体细胞 200 倍
图 b 海马区大锥体细胞 400 倍
图 c 海马区大锥体细胞 1000 倍镜下一段基树突及树突棘图 d Shall Analyze 同心圆2.2.2 通过高尔基染色，各组大鼠海马区锥体细胞树突与 Shall Analyze 同心圆交点数及树突棘密度统计如下：
表 2 各组大鼠海马区锥体细胞树突与同心圆交点数（ ± s， n=200)0d 7d 14d 21d 28dC 组131.08± 14.33132.22± 13.98131.56± 13.44132.57± 11.13134.67± 12.13D 组133.32± 11.98128.00± 12.75▲117.84± 7.58●106.20± 9.98●99.60± 12.64●注：与对照组相比▲p﹤ 0.05，● p﹤ 0.01。
表 3 各组大鼠海马区锥体细胞树突棘密度/20? m（ ± s， n=200)0d 7d 14d 21d 28dC 组16.59± 1.4716.45± 1.7116.03± 1.6115.97± 1.8816.08± 1.65D 组16.45± 1.4415.66± 1.37●15.10± 1.22●14.06± 1.60●12.78± 1.47●注：与对照组相比● p﹤ 0.01。
3 讨论
抑郁症(depression) 是以显著而持久的抑郁情感或心境改变为主要特征的一类疾病,与应激密切相关,而海马是应激因激素作用的靶部位[6]，而其 CA3 区又是应激的敏感亚区。应激可以引起海马区神经元发炎、退行性变、痫样放电以及阻碍神经的发生，进而影响神经元结构和功能的可塑性[7]。我们应用慢性轻度不可预见性应激制作大鼠抑郁模型，选取海马 CA3 区作为研究对象，以树突分支及树突棘变化作为神经元结构可塑性指标。
敞箱实验是最常用的大鼠抑郁行为评价方法之一，水平运动得分反应了大鼠的运动活性水平，垂直活动得分反应其兴趣高低，得分越少说明大鼠的抑郁程度越重。由表 1 可知，14d 的 CUMS 后抑郁症模型组的敞箱实验垂直运动得分和水平运动得分都显著低于正常对照组（ p﹤ 0.01 和 p﹤ 0.05）， 21d宋体仿宋 和 28d 的 CUMS 后，抑郁症模型组的垂直运动得分和水平运动得分都显著低于正常对照组（ p﹤ 0.01）。说明随着刺激的积累，大鼠逐渐出现了抑郁行为，结果与 Katz RJ 等学者所观察的一致。树突棘构成大部分兴奋性突触的突触后膜，是主要的信息加工及储存的场所，树突棘的数目和树突长度可以反映出锥体细胞间的信息联系及传递程度[8]。从表 2 和表3 可知， 7d 的 CUMS 后，海马 CA3 区树突长度与分支与对照组相比开始减少（ p﹤ 0.05），树突棘密度减低（ p﹤ 0.01）。
14d 的 CUMS 后，海马 CA3 区树突长度与分支及树突棘密度与对照组相比均下降（ p﹤ 0.01）。此结果说明 CUMS 引起了海马区神经元结构的改变，而随着刺激的积累这种改变越来越明显。本实验还发现大鼠抑郁行为的出现滞后于神经形态的改变，这可能与神经通路的代偿有关，只有神经损伤致一定程度才表现出抑郁样症状。
综上所述，本实验发现 CUMS 不仅引起大鼠抑郁样行为，还导致了神经元结构的改变，而这种改变也许是海马功能紊乱进而产生抑郁症状的基础。
参考文献
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.Synapse， 2011， 65（ 3） : 198-206．
作者简介：
第一作者：孙岩 硕士研究生、主治医师。
通讯作者：岳新灿 硕士生导师、主任医师、卒中中心主任。
